Enrichissement de la bibliothèque d’ARNm et de bisulfite-ARNm pour le séquençage de nouvelle génération

Résumé

Ce protocole fournit un flux de travail facile à suivre pour effectuer la purification de l’ARN poly(A), la conversion du bisulfite et la préparation de la bibliothèque à l’aide d’un équipement normalisé pour un échantillon biologique d’intérêt.

Résumé

Les modifications post-transcriptionnelles de l’ARN dans divers types de transcrits d’ARN sont associées à une régulation diversifiée de l’ARN dans les cellules eucaryotes. Il a été démontré que les modifications aberrantes de l’ARN 5-méthylcytosine et l’expression dérégulée des ARN méthyltransférases sont associées à diverses maladies, y compris les cancers. Le séquençage au bisulfite à l’échelle du transcriptome a été développé pour caractériser les positions et les niveaux quantitatifs de méthylation de la cytosine dans l’ARN converti au bisulfite à la résolution de la paire de bases. Dans ce document, ce protocole présente en détail les procédures de deux cycles de purification de l’ARN poly(A), de trois cycles de réaction au bisulfite et de la préparation de la bibliothèque pour permettre la cartographie à l’échelle du transcriptome des sites de modification de l’ARNm 5-méthylcytosine. L’évaluation de la quantité et de la qualité de l’ARN après la réaction principale est essentielle pour surveiller l’intégrité de l’ARN et constitue une étape critique pour garantir des banques de séquençage de haute qualité. Idéalement, les procédures peuvent être terminées en trois jours. Avec ce protocole, l’utilisation d’ARN total de haute qualité comme entrée peut pratiquement constituer des banques robustes d’ARNm bisulfite pour le séquençage de nouvelle génération à partir de l’échantillon d’intérêt.

Introduction

Parmi plus de 150 types de modifications post-transcriptionnelles¹, la modification de la 5-méthylcytosine (m⁵C) a été identifiée dans divers types d’ARN, y compris l’ARN ribosomique, l’ARN de transfert, l’ARN messager, le micro-ARN, l’ARN long non codant, l’ARN voûté, l’ARN enhancer et les ARN spécifiques du corps du petit cajal². L’ARN m 5 C est associé à divers mécanismes biologiques et pathologiques tels que la régulation du développement racinaire des plantes 3, l’expression^des gènes viraux⁴ et la progression du cancer⁵. L’....

Protocole

1. Purification de l’ARN poly(A)

REMARQUE : Utiliser l’ARN total traité avec la DNase I et examiner la qualité et l’intégrité de l’ARN total par électrophorèse capillaire ou conventionnelle sur gel avant de procéder à la purification de l’ARN poly(A). Les chercheurs devraient être en mesure d’identifier les bandes ribosomiques d’ARNr 28S et 18S dans le champ de poids moléculaire élevé et la bande d’ARNr 5,8S dans le champ de faible poids moléculaire sans bandes de frottis significatives dans l’électrophérogramme. Les étapes de purification suivent essentiellement les instructions du fabricant avec des modifications mineures i....

Résultats

Une série de banques de séquençage de l’ARNb à partir de lignées^{cellulaires 19} a été générée en suivant les procédures décrites dans ce rapport (Figure 1). Après une purification totale de l’ARN accompagnée d’un traitement à la DNase effectué sur des échantillons de lignées cellulaires et la vérification de la qualité par électrophorèse sur gel et spectrophotométrie UV-Vis (A260/A280), l’échantillon d’ARN peut procéder à l’enrichissement en ARN poly(A.......

Discussion

Dans ce protocole, un pipeline détaillé d’enrichissement en poly(A), de conversion de bisulfite et de préparation de la bibliothèque a été réalisé en utilisant des composants standardisés. D’autres analyses de séquençage ont permis d’identifier l’ARNm 5-méthylcytosine dans des échantillons d’intérêt.

L’étape critique est la qualité du matériau de départ - l’ARN total - car la dégradation de l’ARN aurait un impact sur le taux de récupération de la purification de l’ARN poly(A). L’échantillon do.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agilent 2100 Système de bioanalyseur d’électrophorèse	Agilent, Santa Clara, CA		Détection de la qualité de l’ARN
AMpure XP billes	Beckman Coulter	A63881	purifier l’ADN
Bioanalyseur d’ADN kit haute sensibilité	Agilent, Santa Clara, CA	5067-4626	Détection de la qualité de l’ADN
Bioanalyseur ARN 6000 Kit Pico	Agilent, Santa Clara, CA	5067-1513	ARN détection de la qualité
DiaMag02 - rack magnétique	Diagenode, Denville, NJ	B04000001	aider à la préparation de la bibliothèque
DiaMag1.5 - rack magnétique	Diagenode, Denville, NJ	B04000003	assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT kit de purification	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	61011	poly(A) RNA purificaion ; Tampon de lavage 1 et tampon de lavage 2
Éthanol	J.T.Baker	64-17-5
Kit de méthylation de l’ARN EZ	Zymo, Irvine, CA	R5002	traitement au bisulfite
Luciférase Firefly ARNm	Promega, Madison, WI, États-Unis	L4561	pic de contrôle seqeunce  ;
KAPA Library Quantification Kits	Roche, Switzerland	KK4824	Quantification de la bibliothèque
Spectrophotomètre Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		Détection de la quantité totale d’ARN
NEBNext multiplex Oligos pour illumina (index Primer set1)	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7335S	préparation de la bibliothèque
NEBNext Ultra Kit de préparation de banque d’ARN directionnel pour Illumina	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7760S	Préparation
de bibliothèque sans nucléase Thermo	Fisher Scientific	AM9932
P2 pipetman	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	4641010
fluorimètre Qubit 2.0	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		Détection de la quantité d’ARN
Qubit dsDNA HS Kit de dosage	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32854	Détection de la quantité d’ADN
Qubit RNA HS Kit de dosage	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32852	Détection de la quantité d’ARN