Perfusion hépatique Ex vivo Ex Vivo Normothermic chez la souris

Summary

Un système de perfusion hépatique ex vivo normothermique (NEVLP) a été créé pour les foies de souris. Ce système nécessite de l’expérience en microchirurgie mais permet des résultats de perfusion reproductibles. La capacité d’utiliser des foies de souris facilite l’étude des voies moléculaires pour identifier de nouveaux additifs perfusats et permet l’exécution d’expériences axées sur la réparation d’organes.

Abstract

Ce protocole présente un système NEVLP optimisé sans érythrocytes utilisant des foies de souris. La préservation ex vivo des foies de souris a été réalisée en utilisant des canules modifiées et des techniques adaptées de l’équipement de perfusion ex vivo commercial conventionnel. Le système a été utilisé pour évaluer les résultats de la préservation après 12 heures de perfusion. Les souris C57BL / 6J ont servi de donneurs de foie, et les foies ont été explantés en canulant la veine porte (PV) et le canal biliaire (BD), puis en rinçant l’organe avec une solution saline héparinée chaude (37 ° C). Ensuite, les foies explantés ont été transférés dans la chambre de perfusion et soumis à une perfusion machine oxygénée normotherme (NEVLP). Des échantillons de perfusat à l’entrée et à la sortie ont été prélevés à intervalles de 3 heures pour analyse du perfusat. À la fin de la perfusion, des échantillons de foie ont été obtenus pour analyse histologique, l’intégrité morphologique étant évaluée à l’aide de Suzuki-Score modifié par coloration à l’hématoxyline-éosine (HE). Les expériences d’optimisation ont donné les résultats suivants: (1) les souris pesant plus de 30 g ont été jugées plus appropriées pour l’expérience en raison de la plus grande taille de leur canal biliaire (BD). (2) une canule en polyuréthane de 2 Fr (diamètre extérieur = 0,66 mm) était mieux adaptée à la canulation de la veine porte (PV) qu’une canule en polypropylène. Cela a été attribué à l’adhérence accrue du matériau polyuréthane, ce qui a réduit le glissement du cathéter lors du transfert du corps à la chambre de l’organe. (3) pour la canulation des voies biliaires (BD), une canule en polyuréthane de 1 Fr (diamètre extérieur = 0,33 mm) s’est avérée plus efficace que la canule en polypropylène UT - 03 (diamètre extérieur = 0,30 mm). Avec ce protocole optimisé, les foies de souris ont été préservés avec succès pendant une durée de 12 h sans impact significatif sur la structure histologique. La coloration à l’hématoxyline-éosine (HE) a révélé une architecture morphologique bien préservée du foie, caractérisée par des hépatocytes principalement viables avec des noyaux clairement visibles et une légère dilatation des sinusoïdes hépatiques.

Introduction

La transplantation hépatique représente le traitement de référence pour les personnes atteintes d’une maladie hépatique terminale. Malheureusement, la demande de donneurs d’organes dépasse l’offre disponible, ce qui entraîne une pénurie importante. En 2021, environ 24 936 patients étaient sur la liste d’attente pour une greffe de foie, alors que seulement 9 234 greffes ont été réalisées avec succès¹. La disparité importante entre l’offre et la demande de greffons hépatiques souligne la nécessité urgente d’étudier des stratégies alternatives pour élargir le bassin de donneurs et améliorer l’accessibilité des greffes de foie. Une façon d’élargir ....

Protocol

Les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément à la réglementation et aux directives allemandes en vigueur en matière de bien-être animal et aux directives ARRIVE pour la déclaration de la recherche animale. Le protocole d’expérimentation animale a été approuvé par le Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Thuringe, Allemagne (numéro d’agrément: UKJ - 17 - 106).

NOTE: Des souris mâles C57BL / 6J pesant 34 ± 4 g (moyenne ± erreur type de la moyenne [SEM]) ont été utilisées comme donneurs de foie. Ils ont été maintenus dans des conditions environnementales contrôlées (50% d’humidité et 18 - 23 ° C) avec un accès gratuit à ....

Results

Mise en place d’une intervention chirurgicale
Au total, 17 animaux ont été utilisés pour cette expérience: 14 souris ont été utilisées pour optimiser le processus d’obtention d’organes, y compris la canulation de la veine porte (PV) et du canal biliaire (BD), tandis que 3 souris ont été utilisées pour valider la procédure (tableau 1). Les résultats histologiques (Figure 3) ont été comparés pour faciliter l’identification de l’état optimal de perfusion.

Discussion

Étapes critiques du protocole
Les deux étapes cruciales de l’explantation hépatique sont la canulation de la veine porte (PV) et la canulation subséquente du canal biliaire (BD). Ces étapes sont d’une importance capitale pour assurer le succès du prélèvement d’organes et des procédures ultérieures de perfusion ou de transplantation.

Défis et solutions
La canulation PV présente trois défis : une blessure de la paroi du vaisseau, le déplacement du cathéter.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5 ml Micro Tube PP	Sarstedt	72699
1 Fr Canule en caoutchouc	Vygon	Sample Cannula
10 µ ; L Micro Seringue	Hamilton	701N
2 Fr Canule en caoutchouc	Vygon	Canule
24 g Canule papillon	Terumo	SR+OF2419
26 g Canule papillon	Terumo	SR+DU2619WX
30 g Aiguille hypodermique	Sterican	100246
50 ml Pompe à seringue	Braun	110356
6-0 Perma-Hand Seide	Ethicon	639H
Clip Artériel	Braun	BH014R
Chambre humide autoclavable	Hugo Sachs Elektronik	73-4733
Big Cotton Applicator  ;	NOBA Verbandmittel Danz GmbH	974018
Piège à bulles	Hugo-Sachs-Elektronik	V83163
Buprenovet (0,3 mg / ml)	Elanco	/
CIDEX OPA solution (2 L)	Cilag GmbH	20391
Unité électrochirurgicale pour la coupe monopolaire VIO® ; 50 C	ERBE/
Sérum de veau fœtal (500 ml)  ;	Sigma-Aldrich	F7524-500ML
Mélange de gaz (95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone)	Alimentation domestique	/
chauffage Bains circulants Appareil	de Harvard	75-0310
Héparine 5000 (c’est-à-dire /5 ml)	Braun	1708.00.00
Hydrocortisone (100 mg / 2 ml)	Insuline	15427276
Pfizer(100 IE / ml)	Sigma	I0516-5ML
Ciseaux à iris  ;	Fine Science Instruments	15000-03
Isofluran (250 ml)	Cp-Pharma	1214
Oxygénateur à membrane	Hugo Sachs Elektronik	T18728
Microscope de microchirurgie  ;	Leica	M60
	Carfil Quality	180000056
NanoZoomer 2.0 HT	Hamamatsu	/
Éponges non tissées  ;	Kompressen	866110
Pénicilline Streptomycine (1 mg / ml)  ;	C.C.Pro	Z-13-M
Tube d’extension de perfusion (30 cm)	Braun	4256000
Pompe péristaltique	Harvard-Apparatus	P-70
Petri Dishc 100x15 mm	VWR® ;	391-0578
Povidon-Jod (Vet-Sep Spray)	Livisto	799-416
Simulateur de transducteur de pression	UTAH Medical Products	650-950
Transducteurs de pression artérielle réutilisables	AD Instruments	MLT-0380/D
S & Pince à canulation en T	Fine Science Instruments	00608-11
Petit Applicateur en Coton	NOBA Verbandmittel Danz GmbH	974116
Pince Droite 10 cm  ;	Fine Science Instruments	00632-11
Pince à suture	Fine Science Instruments	11063-07
Seringue 50ml Original Perfusor	Braun	8728810F-06
UT - 03 Canule	Unique Medical, Japon	/
Vannas Spring Scissors	Fine Science Instruments	15018-10
Veterinary Saline (500 ml)	WDT	18X1807
Réservoir à chemise d’eau  ; 2 L	Harvard-Apparatus	73-3441
William’s E Medium (500 ML)	Thermofischer	Scientific A1217601