Kulometrisk respirometri är idealisk för att mäta ämnesomsättningen hos små organismer. När den uppmättaO2-konsumtionen anpassades för Drosophila melanogaster i den aktuella studien låg den inom det intervall som rapporterats för vildtyp D. melanogaster i tidigare studier. Konsumtionen av O2 per fluga hos CASK-mutanter, som är mindre och mindre aktiva, var signifikant lägre än vildtypen.
Kulometrisk mikrorespirometri är en enkel och billig metod för att mätaO2-förbrukningen hos små organismer samtidigt som en stabil miljö upprätthålls. En coulometrisk mikrorespirometer består av en lufttät kammare därO2 förbrukas och den CO2 som produceras av organismen avlägsnas med ett absorberande medium. Den resulterande tryckminskningen utlöser elektrolytiskO2-produktion , och mängden O2 som produceras mäts genom att registrera mängden laddning som används för att generera den. I den aktuella studien har metoden anpassats till Drosophila melanogaster som testats i små grupper, med apparatens känslighet och miljöförhållanden optimerade för hög stabilitet. Mängden O2 som konsumeras av vildtypsflugor i denna apparat överensstämmer med den som uppmätts i tidigare studier. MassspecifikO2-konsumtion av CASK-mutanter , som är mindre och kända för att vara mindre aktiva, skilde sig inte från kongena kontroller. Den lilla storleken på CAS-mutanter resulterade dock i en signifikant minskning avO2-konsumtionen per fluga. Därför kan mikrorespirometern mätaO2-förbrukningen i D. melanogaster, kan skilja blygsamma skillnader mellan genotyper och lägger till ett mångsidigt verktyg för att mäta ämnesomsättningen.
Förmågan att mäta ämnesomsättningen är avgörande för en fullständig förståelse av en organism i dess miljösammanhang. Till exempel är det nödvändigt att mäta ämnesomsättningen för att förstå dess roll i livslängd1, kostens roll i ämnesomsättningen2 eller tröskeln för hypoxisk stress3.
Det finns två allmänna metoder för att mäta ämnesomsättningen4. Direkt kalorimetri mäter energiförbrukningen direkt genom att mäta värmeproduktionen. Indirekt kalorimetri mäter energiproduktion på andra sätt, ofta via respirometrisk mätning av O2-förbrukning (VO2), CO2-produktion eller båda. Även om direkt kalorimetri har tillämpats på små ektotermer, inklusive Drosophila melanogaster5, är respirometri tekniskt enklare och mer vanligt förekommande.
Flera former av respirometri har använts framgångsrikt för att mäta ämnesomsättningen hos vildtyp och mutant D. melanogaster och har gett insikt i de metabola effekterna av temperatur6, social miljö 3, kost 3,7 och neuropsykiatriska funktionsnedsättningar8. Dessa kan delas in i två klasser, som varierar avsevärt i kostnad och komplexitet. Manometri är den enklaste och billigaste9,10, där flugor placeras i en förseglad kammare som innehåller en CO2 -absorbent och som är ansluten via en tunn kapillär till en vätskereservoar. När O 2 förbrukas och CO2 absorberas minskar trycket i kammaren och vätska dras in i kapillären. Kapillärens vätskefyllda volym är därför proportionell mot VO2. Mer avancerade versioner, som kompenserar för kraften som utövas av vätskan i kapillären, har också använts på D. melanogaster1. Manometri har fördelen av att vara enkel och billig, men eftersom den är känslig för tryck kräver den konstanta miljöförhållanden. Vidare, eftersom förbrukad O 2 inte ersätts, minskar partialtrycket för O2 (PO2) gradvis inuti kamrarna.
Respirometri med gasanalys används också regelbundet för D. melanogaster. I detta fall provtas gaser med jämna mellanrum från förseglade kammare som innehåller flugor och skickas till en infraröd analysator 2,6,11. Denna typ av apparat har fördelarna att den är tillgänglig kommersiellt, är mindre känslig för miljöförhållanden och gaser fylls på under provtagningen så att PO2 förblir stabil. Utrustningen kan dock vara dyr och komplicerad att använda.
En nyutvecklad coulometrisk mikrorespirometer12 ger ett billigt, känsligt och stabilt alternativ till befintliga system. I praktiken placeras en organism i en lufttät kammare där den förbrukar O 2 och den utandade CO2 avlägsnas av ett absorberande material, vilket resulterar i en nettominskning av kammartrycket. När det inre trycket sjunker till en förinställd tröskel (ON-tröskel), leds ström genom en elektrolytisk O2-generator, vilket återför trycket till en andra tröskel (OFF-tröskel) som stoppar elektrolys. Laddningsöverföringen över O2-generatorn är direkt proportionell mot mängdenO2 som krävs för att åter trycksätta kammaren och kan därför användas för att mäta O2 som förbrukas av organismen4. Metoden är mycket känslig, mäter V O2 exakt, och regelbunden ersättning av O2 kan hålla PO2 på en nästan konstant nivå i timmar eller dagar.
Den coulometriska mikrorespirometern som används i denna studie använder en multimodal (tryck, temperatur och luftfuktighet) elektronisk sensor. Sensorn drivs av en mikrokontroller som detekterar små tryckförändringar och aktiverar O2-generering när en lågtryckströskel nås12. Denna apparat är sammansatt av hylldelar, kan användas med en mängd olika kammare och experimentella miljöer och har använts framgångsrikt för att undersöka effekterna av kroppsmassa och temperatur på skalbaggen Tenebrio molitor. I den aktuella studien har mikrorespirometern anpassats för att mätaO2-förbrukningen i D. melanogaster, som har cirka 1 % av massan av T. molitor. Apparatens känslighet har ökats genom att sänka tröskeln för aktivering avO2-generering , och miljöstabiliteten har förbättrats genom att utföra experiment i ett temperaturkontrollerat vattenbad och genom att hålla luftfuktigheten inuti kamrarna på eller nära 100 %.
Proteinet CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), en del av familjen membranassocierade guanylatkinaser (MAGUK), är en molekylär struktur i olika multiproteinkomplex, och mutationer i CASK är associerade med utvecklingsneurologiska störningar hos människor och i D. melanogaster13,14. En livskraftig D. melanogaster-mutant, CASKΔ18, stör aktiviteten hos dopaminerga nervceller 15 och minskar aktivitetsnivåerna med mer än 50 % jämfört med kongena kontroller14,16. På grund av de minskade aktivitetsnivåerna hos CASK-mutanter och katekolaminers roll i regleringen av metabolismen17 antog vi att deras standardmetabolism, och därmedO2-konsumtion, skulle minska dramatiskt jämfört med kontroller.
Konsumtionen av O2 mättes i CASKΔ18 och deras vildtypskongener, w(ex33). Grupper av flugor placerades i respirometrikammare, O2 konsumtion mättes, O2 förbrukning beräknades och uttrycktes både på massspecifik och per fluga. Apparaten registrerade VO2 i vildtypsflugor som överensstämde med tidigare studier, och den kunde skilja mellan O 2-konsumtionen per fluga av vildtypsflugor och CASK-muterade flugor.
Ovanstående procedur visar mätning avO2-förbrukningen i D. melanogaster med hjälp av en elektronisk coulometrisk mikrorespirometer. De resulterande uppgifterna förO2-konsumtion hos vildtyp D. melanogaster låg inom de intervall som beskrivits i de flesta tidigare publikationer med olika metoder (tabell 1), även om de var något lägre än de som rapporterats av andra 3,6.
K…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr. Linda Restifo vid University of Arizona för att ha föreslagit att testaO2-konsumtionen av CASK-mutanter och för att ha skickat CASK-mutanter och deras kongena kontroller. Publiceringsavgifter tillhandahölls av Departmental Reinvestment Fund från biologiska institutionen vid University of College Park. Utrymme och viss utrustning tillhandahölls av universiteten i Shady Grove.
19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |