電量マイクロレスピロメトリーを用いたショウジョウバエのメラノガスターにおけるO2消費量の測定
Summary
電量呼吸法は、小さな生物の代謝率を測定するのに理想的です。本研究においてショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)に適応させた場合、測定されたO2消費量は、以前の研究によって野生型D.melanogasterについて報告された範囲内であった。CASK変異体によるハエ当たりのO2消費量は、より小さく、活性が低く、野生型よりも有意に低かった。
Abstract
電量マイクロレスピロメトリーは、安定した環境を維持しながら、小さな生物のO2消費量を測定するための簡単で安価な方法です。電量マイクロレスピロメーターは、O2が消費され、生物によって生成されたCO2が吸収媒体によって除去される気密チャンバーで構成されています。 得られた圧力低下は電解O2生成を誘発し、生成に使用された電荷量を記録することにより、生成したO2の量を測定する。本研究では、この方法を小グループで試験したショウジョウバエのメラノガスターに適合させ、装置の感度と環境条件を高い安定性のために最適化しました。この装置で野生型ハエが消費するO2の量は、以前の研究によって測定された量と一致しています。CASK変異体による質量特異的O2消費は、より小さく、活性が低いことが知られており、コンジェニックコントロールと変わらなかった。しかし、CASK変異体のサイズが小さいため、ハエ当たりのO2消費量が大幅に減少しました。したがって、マイクロレスピロメーターは、D. melanogasterのO2消費量を測定することができ、遺伝子型間のわずかな違いを区別することができ、代謝率を測定するための汎用性の高いツールを追加します。
Introduction
代謝率を測定する能力は、環境的文脈における生物を完全に理解するために重要です。例えば、寿命1における食事の役割、代謝における食事の役割2、低酸素ストレスの閾値3を理解するためには、代謝率を測定する必要があります。
代謝率の測定には、2つの一般的なアプローチがあります4。直接熱量測定は、熱産生を測定することにより、エネルギー消費量を直接測定します。間接熱量測定は、他の手段、多くの場合、O2 消費量(VO2)、CO2 生産、またはその両方の呼吸測定を介してエネルギー生産を測定します。直接熱量測定は、 ショウジョウバエのmelanogaster5を含む小さな外温動物に適用されていますが、スピロメトリーは技術的により単純で、より一般的に使用されています。
野生型および変異体D. melanogasterの代謝率を測定するために、いくつかの形態のスピロメトリーが成功裏に使用され、体温6、社会環境3、食事3,7、および神経発達障害8の代謝効果に関する洞察が得られました。これらは 2 つのクラスに分類され、コストと複雑さが大きく異なります。マノメトリーは最も単純で最も安価な9,10であり、ハエはCO2吸収剤を含み、薄いキャピラリーを介して液体リザーバーに接続されている密閉チャンバーに入れられます。O2が消費され、CO2が吸収されると、チャンバー内の圧力が低下し、流体がキャピラリーに引き込まれます。したがって、キャピラリーの流体で満たされた体積はVOに比例します2。毛細血管内の流体によって加えられる力を補正する、より精巧なバージョンもD. melanogaster1で使用されています。マノメトリーには、シンプルで安価であるという利点がありますが、圧力に敏感であるため、一定の環境条件が必要です。また、消費されたO2は置換されないため、チャンバー内のO2(PO2)の分圧は徐々に低下する。
ガス分析を用いた呼吸法は、D. melanogasterにも定期的に使用されています。この場合、ガスは、ハエを含む密閉チャンバーから一定の間隔でサンプリングされ、赤外線分析装置に送られる2,6,11。このタイプの装置には、市販されており、環境条件の影響を受けにくく、サンプリング中にガスがリフレッシュされるため、PO2が安定しているという利点があります。ただし、機器は高価で操作が複雑になる可能性があります。
最近開発された電量マイクロレスピロメータ12は、既存のシステムに代わる安価で高感度かつ安定した代替手段を提供する。実際には、生物はO2を消費する気密チャンバーに入れられ、呼気されたCO2は吸収性材料によって除去され、チャンバー圧力の正味の低下をもたらします。内圧が予め設定された閾値(ON閾値)まで低下すると、電解O2発生器に電流が流れ、圧力を第2の閾値(OFF閾値)に戻して電気分解を停止する。O2発生器を横切る電荷移動は、チャンバを再加圧するのに必要なO2の量に正比例し、したがって、生物4によって消費されるO2を測定するために使用することができる。この方法は感度が高く、VO2を正確に測定し、O 2の定期的な交換により、数時間または数日間、PO2をほぼ一定のレベルに維持できます。
この研究で使用された電量マイクロレスピロメーターは、マルチモーダル(圧力、温度、湿度)電子センサーを採用しています。センサは、圧力のわずかな変化を検出し、低圧閾値に達するとO2生成を作動させるマイクロコントローラによって動作する12。この装置は既製の部品から組み立てられ、さまざまなチャンバーや実験環境で使用でき、カブトムシテネブリオモリターの体重と温度の影響を調べるのに成功しています。本研究では、マイクロレスピロメーターは、T. molitor の質量の約 1% を有する D. melanogaster のO 2 消費量を測定するように適合されています。O2生成を活性化する閾値を小さくすることで装置の感度を高め、温度管理された水槽で実験を行い、チャンバー内の湿度を100%近くに維持することで環境安定性を高めました。
膜関連グアニル酸キナーゼ(MAGUK)ファミリーの一部であるCASK(カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ)タンパク質は、さまざまな多タンパク質複合体の分子足場であり、KASKの変異はヒトおよびD. melanogasterの神経発達障害と関連している13,14。生存可能なD.メラノガスター変異体であるCASKΔ18は、ドーパミン作動性ニューロンの活性を阻害し15、コンジェニックコントロールと比較して活性レベルを50%以上低下させる14,16。KASK変異体の活性レベルの低下と代謝調節におけるカテコールアミンの役割17のために、我々はそれらの標準代謝率、したがってO2消費量が対照と比較して劇的に減少すると仮定した。
O2 消費量は、CASKΔ18 およびそれらの野生型同族体 w(ex33) で測定されました。ハエのグループをスピロメトリーチャンバーに入れ、O 2消費量を測定し、O2消費量を計算し、質量比ベースとハエあたりベースの両方で発現させた。この装置は、野生型ハエのV O2を記録し、これは以前の研究と一致しており、野生型ハエとKASK変異ハエのハエあたりのO2消費量を区別することができました。
Protocol
Representative Results
Discussion
上記の手順は、電子電量マイクロレスピロメーターを使用したD.メラノガスターにおけるO2消費量の測定を示しています。野生型D.melanogasterにおけるO2消費の結果のデータは、他の研究者によって報告されたものよりやや低いものの、多様な方法(表1)を用いた以前のほとんどの出版物に記載されている範囲内であった3,6<sup clas…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
アリゾナ大学のリンダ・レスティフォ博士には、KASK変異体のO2 消費の試験を提案し、KASK変異体とそのコンジェニックコントロールを送っていただいたことに感謝します。出版料は、カレッジパーク大学の生物学部から部門再投資基金によって提供されました。スペースといくつかの機器は、シェイディグローブの大学から提供されました。
Materials
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
References
- Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila. Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).
- Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H. Dietary nutrient balance shapes phenotypic traits of Drosophila melanogaster in interaction with gut microbiota. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 241, 110626 (2020).
- Burggren, W., Souder, B. M., Ho, D. H. Metabolic rate and hypoxia tolerance are affected by group interactions and sex in the fruit fly (Drosophila melanogaster): new data and a literature survey. Biology Open. 6, 471-480 (2017).
- Lighton, J. R. B. . Measuring Metabolic Rates. , (2019).
- Fiorino, A., et al. Parallelized, real-time, metabolic-rate measurements from individual Drosophila. Scientific Reports. 8 (1), 14452 (2018).
- Berrigan, D., Partridge, L. Influence of temperature and activity on the rate of adult Drosophila melanogaster. Comparative Biochemistry and Physiology. 118 (4), 1301-1307 (1997).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39 (8), 1137-1143 (2004).
- Botero, V., et al. Neurofibromin regulates metabolic rate via neuronal mechanisms in Drosophila. Nature Communications. 12 (1), 4285 (2021).
- Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry. Journal of Visualized Experiments. (88), 51681 (2014).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46 (11), 1477-1480 (2000).
- Brown, E. B., Klok, J., Keene, A. C. Measuring metabolic rate in single flies during sleep and waking states via indirect calorimetry. Journal of Neuroscience Methods. 376, 109606 (2022).
- Sandstrom, D. J., Offord, B. W. Measurement of oxygen consumption in Tenebrio molitor using a sensitive, inexpensive, sensor-based coulometric microrespirometer. Journal of Experimental Biology. 225 (9), jeb243966 (2022).
- Becker, M., et al. Presynaptic dysfunction in CASK-related neurodevelopmental disorders. Translational Psychiatry. 10 (1), 312 (2020).
- Slawson, J. B., et al. Central Regulation of Locomotor Behavior of Drosophila melanogaster Depends on a CASK Isoform Containing CaMK-Like and L27 Domains. Génétique. 187 (1), 171-184 (2011).
- Slawson, J. B., et al. Regulation of dopamine release by CASK-Î2 modulates locomotor initiation in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. Journal of Neurogenetics. 35 (1), 1-22 (2021).
- Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine Modulates Metabolic Rate and Temperature Sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7 (2), e31513 (2012).
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Lack of correlation between body mass and metabolic rate in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 50 (5), 445-453 (2004).
- Norton, F. J. Permeation of gases through solids. Journal of Applied Physics. 28 (1), 34-39 (1957).
- Hoegh-Guldberg, O., Manahan, D. T. Coulometric measurement of oxygen-consumption during development of marine invertebrate embryos and larvae. Journal of Experimental Biology. 198 (1), 19-30 (1995).
- Sohal, R. S., Agarwal, A., Agarwal, S., Orr, W. C. Simultaneous overexpression of copper- and zinc-containing superoxide dismutase and catalase retards age-related oxidative damage and increases metabolic potential in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Chemistry. 270 (26), 15671-15674 (1995).
- Van Voorhies, W. A., Melvin, R. G., Ballard, J. W. O., Williams, J. B. Validation of manometric microrespirometers for measuring oxygen consumption in small arthropods. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1132-1137 (2008).
- Herreid, C. F., Full, R. J. Cockroaches on a treadmill: Aerobic running. Journal of Insect Physiology. 30 (5), 395-403 (1984).
