脊髄刺激時の運動ニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録のための脊髄スライスの ex vivo 調製
Summary
このプロトコルは研究者が脊髄を分け、細胞生存率を同時に維持することの彼らの技術を改善するのを助けることができる高い時空間決断の脊髄の刺激(SCS)への運動ニューロンの電気応答を調査するのにパッチ・クランプを使用して方法を記述する。
Abstract
脊髄刺激(SCS)は、脊髄損傷(SCI)後の自発運動機能を効果的に回復させることができます。運動ニューロンは感覚運動行動を実行する最後のユニットであるため、SCSによる運動ニューロンの電気的応答を直接研究することは、脊髄運動調節の根底にあるロジックを理解するのに役立ちます。多様な刺激特性と細胞応答を同時に記録するには、パッチクランプが単一細胞スケールで電気生理学的特性を研究するのに適した方法です。しかし、この目標を達成するには、細胞の生存率を維持すること、脊髄を骨構造から迅速に分離すること、SCSを使用して活動電位をうまく誘導することなど、まだいくつかの複雑な困難があります。本稿では、運動ニューロンのSCSに対する電気的応答を高い時空間分解能で研究し、脊髄の分離と細胞生存率の維持を同時に行う技術を向上させ、運動ニューロン上のSCSの電気的メカニズムを円滑に研究し、無駄な試行錯誤を避けるための詳細なプロトコールを提示する。
Introduction
脊髄刺激(SCS)は、脊髄損傷(SCI)後の自発運動機能を効果的に回復させることができます。Andreas Rowaldらは、SCSが下肢の自発運動と体幹機能を1日で可能にすることを報告しました1。自発運動回復のためのSCSの生物学的メカニズムを探ることは、より正確なSCS戦略を開発するための重要かつトレンドの研究分野です。例えば、Grégoire Courtineのチームは、脊髄の興奮性Vsx2介在ニューロンとHoxa10ニューロンがSCSに応答する重要なニューロンであり、細胞特異的なニューロモデュレーションがSCI2後のラットの歩行能力を回復するために実行可能であることを実証しました。しかし、単一細胞スケールでのSCSの電気的メカニズムに焦点を当てた研究はほとんどありません。古典的なイカ実験3,4,5では、閾値超の直流刺激が活動電位(AP)を誘発できることはよく知られていますが、SCSなどのパルス交流電気刺激が運動信号の生成にどのように影響するかはまだ不明です。
脊髄内神経回路の複雑さを考えると、SCSの電気的メカニズムを調べるためには、細胞集団の適切な選択が重要です。SCSは固有受容経路6を活性化することによって運動機能を回復させるが、運動ニューロンは、固有受容感覚情報の求心性入力7の統合から導かれる運動指令を実行する最後の単位である。したがって、SCSで運動ニューロンの電気的特性を直接研究することは、脊髄運動調節の根底にある論理を理解するのに役立ちます。
周知のように、パッチクランプは、極めて高い時空間分解能を有する細胞電気生理学的記録のゴールデンスタンダードな方法である8。そこで、本研究では、SCSに対する運動ニューロンの電気的応答を研究するためにパッチクランプを用いて方法を検討する。脳パッチクランプ9と比較して、脊髄パッチクランプは、以下の理由により、より困難である:(1)脊髄は、より優れた細胞生存率を得るために、非常に細かいマイクロマニピュレーションと厳密な氷冷メンテナンスを必要とする、小さな体積の脊柱管によって保護されている。(2)脊髄は細すぎて切断トレイに固定できないため、低融点アガロースに浸漬し、固化後にトリミングする必要があります。
したがって、この方法は、脊髄を解剖し、同時に細胞の生存率を維持するための技術的な詳細を提供し、運動ニューロン上のSCSの電気的メカニズムをスムーズに研究し、不必要な試行錯誤を回避します。
Protocol
施設動物実験委員会は、すべての動物実験を承認し、研究は関連する動物福祉規則に従って実施されました。 1.動物の調製 動物住居情報:特定の病原体のない環境での雄のSprague-Dawleyラット(出生後10〜14日、P10〜P14)を飼育します。注:室内条件は20°C±2°C、湿度:50%〜60%、12時間の明暗サイクルで維持されました。動物は食べ物と水を自由に入手?…
Representative Results
微細な操作中の厳格な低温維持(補足図1、補足図2、および図1)のおかげで、細胞生存率はその後の電気生理学的記録を実行するのに十分良好でした。臨床シナリオを可能な限りシミュレートするために、マイクロマニピュレーションを使用して、SCS陰極と陽極をそれぞれ背側正中線とDREZの近くに配置し(図2)、後角の神経信号を開始し?…
Discussion
SCSによって変調された運動情報は、最終的に運動ニューロンに収束されます。したがって、運動ニューロンを研究対象とすることで、研究デザインが簡素化され、SCSの神経調節メカニズムがより直接的に明らかになる可能性があります。多様な刺激特性と細胞応答を同時に記録するには、パッチクランプが単一細胞スケールで電気生理学的特性を研究するのに適した方法です。しかし、細胞?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学基金会の若手研究者(52207254および82301657)および中国ポスドク科学基金(2022M711833)から資金提供を受けました。
Materials
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
References
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Citer Cet Article
Yao, Q., Luo, X., Liu, J., Li, L. The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation. J. Vis. Exp. (199), e65385, doi:10.3791/65385 (2023).