Langsigtet billeddannelse af identificerede neurale populationer ved hjælp af mikroprismer i frit bevægelige og hovedfikserede dyr
Summary
Når mikroprismelinsen integreres med en hovedplade og et optisk design, der er kompatibelt med både enkelt- og to-fotonmikroskoper, udgør den en betydelig fordel ved måling af neurale reaktioner i en lodret søjle under forskellige forhold, herunder velkontrollerede eksperimenter i hovedfaste tilstande eller naturlige adfærdsopgaver i dyr, der bevæger sig frit.
Abstract
Med udviklingen af multifotonmikroskopi og molekylære teknologier vokser fluorescensbilleddannelse hurtigt til at blive en stærk tilgang til at studere strukturen, funktionen og plasticiteten af levende hjernevæv. I sammenligning med konventionel elektrofysiologi kan fluorescensmikroskopi fange den neurale aktivitet såvel som cellernes morfologi, hvilket muliggør langsigtede registreringer af de identificerede neuronpopulationer ved enkeltcelle eller subcellulær opløsning. Imidlertid kræver billeddannelse i høj opløsning typisk en stabil, hovedfast opsætning, der begrænser dyrets bevægelse, og forberedelsen af en flad overflade af gennemsigtigt glas tillader visualisering af neuroner på et eller flere vandrette planer, men er begrænset til at studere de lodrette processer, der løber over forskellige dybder. Her beskriver vi en procedure til at kombinere en hovedpladefiksering og et mikroprisme, der giver flerlags og multimodal billeddannelse. Dette kirurgiske præparat giver ikke kun adgang til hele kolonnen i musens visuelle cortex, men tillader to-fotonbilleddannelse i en hovedfast position og en-fotonbilleddannelse i et frit bevægeligt paradigme. Ved hjælp af denne tilgang kan man prøve identificerede cellepopulationer på tværs af forskellige kortikale lag, registrere deres svar under hovedfaste og frit bevægelige tilstande og spore de langsigtede ændringer over måneder. Således giver denne metode et omfattende assay af mikrokredsløbene, hvilket muliggør direkte sammenligning af neurale aktiviteter fremkaldt af velkontrollerede stimuli og under et naturligt adfærdsparadigme.
Introduction
Fremkomsten af in vivo to-foton fluorescerende billeddannelse 1,2, der kombinerer de nye teknologier inden for optiske systemer og genetisk modificerede fluorescensindikatorer, har vist sig som en kraftfuld teknik inden for neurovidenskab til at undersøge den indviklede struktur, funktion og plasticitet i den levende hjerne 3,4. Især tilbyder denne billeddannelsesmodalitet en enestående fordel i forhold til traditionel elektrofysiologi ved at fange både neuronernes morfologi og dynamiske aktiviteter og derved lette langsigtet sporing af identificerede neuroner 5,6,7,8.
På trods af sine bemærkelsesværdige styrker kræver anvendelsen af fluorescensbilleddannelse med høj opløsning ofte en statisk, hovedfast opsætning, der begrænser dyrets mobilitet 9,10,11. Derudover begrænser brugen af en gennemsigtig glasoverflade til visualisering af neuroner observationer til et eller flere vandrette planer, hvilket begrænser udforskningen af dynamikken i vertikale processer, der strækker sig over forskellige kortikale dybder12.
Ved at adressere disse begrænsninger skitserer denne undersøgelse en innovativ kirurgisk procedure, der integrerer hovedpladefiksering, mikroprisme og miniskop for at skabe en billeddannelsesmodalitet med flerlags og multimodale muligheder. Mikroprismet tillader observation af den lodrette behandling langs den kortikale søjle 13,14,15,16, hvilket er afgørende for at forstå, hvordan information behandles og transformeres, når den bevæger sig gennem forskellige lag af cortex, og hvordan den lodrette behandling ændres under plastiske ændringer. Desuden tillader det billeddannelse af de samme neurale populationer i et hovedfikseret paradigme og i en frit bevægelig indstilling, der omfatter de alsidige eksperimentelle indstillinger 17,18,19: for eksempel kræves hovedfiksering ofte til velkontrollerede paradigmer som sensorisk opfattelsesvurdering og stabile optagelser under 2-fotonparadigme, mens fri bevægelse tilbyder et mere naturligt, fleksibelt miljø til adfærdsstudier. Derfor er evnen til at foretage en direkte sammenligning i begge tilstande afgørende for at fremme vores forståelse af de mikrokredsløb, der muliggør fleksible, funktionelle reaktioner.
I det væsentlige tilbyder integrationen af hovedpladefiksering, mikroprisme og miniskop i fluorescensbilleddannelse en lovende platform til at undersøge forviklingerne i hjernens struktur og funktionalitet. Forskere kan prøve identificerede cellepopulationer på tværs af forskellige dybder, der spænder over alle kortikale lag, direkte sammenligne deres reaktioner i både velkontrollerede og naturlige paradigmer og overvåge deres langsigtede ændringer over måneder20. Denne tilgang giver værdifuld indsigt i, hvordan disse neurale populationer interagerer og ændrer sig over tid under forskellige eksperimentelle forhold, hvilket giver et vindue ind i den dynamiske natur af neurale kredsløb.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi vist evnen til at observere og direkte sammenligne neuroner i hovedfaste og frit bevægelige forhold i de samme neurale populationer. Mens vi demonstrerede applikationen i den visuelle cortex, kan denne protokol tilpasses en lang række andre hjerneområder, både kortikale områder og dybe kerner 24,25,26,27,28 samt andre dataindsamlings- og adfærdsopsætninger</s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker fru Charu Reddy og professor Matteo Carandini (Cortex Lab) for deres råd om kirurgisk protokol og deling af transgen musestamme. Vi takker Dr. Norbert Hogrefe (Inscopix) for hans vejledning og hjælp gennem udviklingen af operationen. Vi takker Andreea Aldea (Sun Lab) for hendes hjælp med den kirurgiske opsætning og databehandling. Dette arbejde blev støttet af Moorfields Eye Charity.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Saline for hydration and drug reconsitution |
| 18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur | FST | 18004-18 | Drill bit |
| 1ml syringe | Terumo | MDSS01SE | 1ml syringe |
| 23G x 5/8 inch 6% LUER needle | Terumo | NN-2316R | 23G needle |
| 71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software | RWD | – | RWD |
| Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | gel-foam |
| Alcohol pads 70% isopropyl alcohol | Braun | 9160612 | Alcohol pads |
| Aluminium foil | Any retailer | – | Foil to cover eyes during surgery |
| Articifical Cerebrospinal Fluid | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
| Automated microinjection pump | WPI | 8091 | |
| Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
| Bruker Ultime 2Pplus (customised) | Bruker | – | Two-photon imaging system |
| Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Anaesthesia absorber |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x objective lens |
| Compact Anaesthesia system – single gas – isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit | Vet-Tech | AN001 | Compact anaesthesia system |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Disinfectant (hypochlorous acid) |
| Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | Dexamethasone |
| Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel | Fine Science Tools | 10055-12 | Knife for incisino of cortex |
| Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars | Stoelting | 51649 | Ear bar |
| Dummy microscope | Inscopix | Dummy microscope | To help with implantation |
| Ethanol (100%) | VWR | 40-1712-25 | Used to make 70% ethanol |
| Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | Gloves |
| Homeothermic Monitor 50-7222-F | Harvard Apparatus | 50-7222-F | Homeothermic monitoring system/heating pad |
| Image processing software | ImageJ | – | Image processing software |
| Inscopix Data Processing Software (IDPS) | Inscopix | – | One-photon calcium imaging processing software |
| Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Two-photon imaging laser |
| IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
| Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive | World Precision Intruments (WPI) | KWIK-SIL | Silicone adhesive |
| MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E | PROXXON | NO 28 515 | Handheld drill |
| nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package | Inscopix | – | One-photon Imaging system and software |
| ProView Implant Kit | Inscopix | ProView Implant Kit | Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment |
| ProView Prism Probe | Inscopix | 1050-002203 | Microprism lens |
| Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
| Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp | WPI | PZMTIII-AAC | Microscope |
| Super-Bond Universal kit, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhesive cement |
| Two-photon calcium image software | Suite2P | – | Two-photon calcium imaging processing software |
| Vapouriser | Vet-Tech | – | Isoflurane vapouriser |
| Xailin Lubricating Eye Ointment 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Ophthalmic ointment |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Vaziri, A., Emiliani, V. Reshaping the optical dimension in optogenetics. Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 128-137 (2012).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Sun, Y. J., Sebastian Espinosa, J., Hoseini, M. S., Stryker, M. P. Experience-dependent structural plasticity at pre- and postsynaptic sites of layer 2/3 cells in developing visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21812-21820 (2019).
- Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Reid, R. C. Chronic cellular imaging of mouse visual cortex during operant behavior and passive viewing. Front Cell Neurosci. 4, 3 (2010).
- Sofroniew, N. J., Flickinger, D., King, J., Svoboda, K. A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging. Elife. 5, 14472 (2016).
- Puścian, A., Benisty, H., Higley, M. J. NMDAR-dependent emergence of behavioral representation in primary visual cortex. Cell Rep. 32 (4), 107970 (2020).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo. imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Seaton, G., et al. Dual-component structural plasticity mediated by αCaMKII autophosphorylation on basal dendrites of cortical layer 2/3 neurones. J Neurosci. 40 (11), 2228-2245 (2020).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
- Chia, T. H., Levene, M. J. Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging. J Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: Imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (52), 18739-18744 (2014).
- Buxhoeveden, D. P., Casanova, M. F. The minicolumn hypothesis in neuroscience. Brain. 125, 935-951 (2002).
- Chen, S., et al. Miniature fluorescence microscopy for imaging brain activity in freely-behaving animals. Neurosci Bull. 36 (10), 1182-1190 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. J Vis Exp. (124), e55579 (2017).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), 88678 (2014).
- Wekselblatt, J. B., Flister, E. D., Piscopo, D. M., Niell, C. M. Large-scale imaging of cortical dynamics during sensory perception and behavior. J Neurophysiol. 115 (6), 2852-2866 (2016).
- Pnevmatikakis, E. A., et al. Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of calcium imaging data. Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomed Opt Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
- Wenzel, M., Hamm, J. P., Peterka, D. S., Yuste, R. Reliable and elastic propagation of cortical seizures in. Cell Rep. 19 (13), 2681-2693 (2017).
- Heys, J. G., Rangarajan, K. V., Dombeck, D. A. The functional micro-organization of grid cells revealed by cellular-resolution imaging. Neuron. 84 (5), 1079-1090 (2014).
- Barson, D., Hamodi, A. S. Simultaneous mesoscopic and two-photon imaging of neuronal activity in cortical circuits. Nat Methods. 17 (1), 107-113 (2020).
- Paquelet, G. E., et al. Single-cell activity and network properties of dorsal raphe nucleus serotonin neurons during emotionally salient behaviors. Neuron. 110 (16), 2664-2679 (2022).
- Yang, Q., et al. Transparent microelectrode arrays integrated with microprisms for electrophysiology and simultaneous two-photon imaging across cortical layers. bioRxiv. , (2022).
- Priestley, J. B., Bowler, J. C., Rolotti, S. V., Fusi, S., Losonczy, A. Signatures of rapid plasticity in hippocampal CA1 representations during novel experiences. Neuron. 110 (12), 1978-1992 (2022).
- Zong, W., et al. Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging. Nat Methods. 18 (1), 46-49 (2021).
- Engelbrecht, C. J., et al. Ultra-compact fiber-optic two-photon microscope for functional fluorescence imaging in vivo. Opt Express. 16 (8), 5556-5564 (2008).
- Suzuki, M., Aru, J., Larkum, M. E. Double-μ Periscope, a tool for multilayer optical recordings, optogenetic stimulations or both. Elife. 10, 72894 (2021).
- Stibůrek, M., et al. 110 μm thin endo-microscope for deep-brain in vivo observations of neuronal connectivity, activity and blood flow dynamics. Nat Commun. 14 (1), 1897 (2023).
