Imagerie à long terme de populations neuronales identifiées à l’aide de microprismes chez des animaux se déplaçant librement et avec la tête fixe
Summary
Lorsqu’elle est intégrée à une plaque de tête et à une conception optique compatible avec les microscopes à un ou deux photons, la lentille à microprisme présente un avantage significatif pour mesurer les réponses neuronales dans une colonne verticale dans diverses conditions, y compris des expériences bien contrôlées dans des états de tête fixe ou des tâches comportementales naturelles chez des animaux en mouvement libre.
Abstract
Avec les progrès de la microscopie multiphotonique et des technologies moléculaires, l’imagerie par fluorescence se développe rapidement pour devenir une approche puissante pour étudier la structure, la fonction et la plasticité des tissus cérébraux vivants. Par rapport à l’électrophysiologie conventionnelle, la microscopie à fluorescence peut capturer l’activité neuronale ainsi que la morphologie des cellules, permettant des enregistrements à long terme des populations de neurones identifiées à une résolution unicellulaire ou subcellulaire. Cependant, l’imagerie haute résolution nécessite généralement une configuration stable et fixe à la tête qui limite le mouvement de l’animal, et la préparation d’une surface plane en verre transparent permet de visualiser les neurones à un ou plusieurs plans horizontaux, mais est limitée dans l’étude des processus verticaux à différentes profondeurs. Ici, nous décrivons une procédure pour combiner une fixation de plaque de tête et un microprisme qui donne une imagerie multicouche et multimodale. Cette préparation chirurgicale donne non seulement accès à toute la colonne du cortex visuel de la souris, mais permet une imagerie à deux photons en position fixe de la tête et une imagerie à un photon dans un paradigme en mouvement libre. En utilisant cette approche, on peut échantillonner des populations cellulaires identifiées à travers différentes couches corticales, enregistrer leurs réponses sous des états fixes et mobiles et suivre les changements à long terme sur des mois. Ainsi, cette méthode fournit un test complet des microcircuits, permettant une comparaison directe des activités neuronales évoquées par des stimuli bien contrôlés et sous un paradigme comportemental naturel.
Introduction
L’avènement de l’imagerie fluorescente à deux photons in vivo 1,2, combinant les nouvelles technologies des systèmes optiques et des indicateurs de fluorescence génétiquement modifiés, est devenu une technique puissante en neurosciences pour étudier la structure, la fonction et la plasticité complexes du cerveau vivant 3,4. En particulier, cette modalité d’imagerie offre un avantage inégalé par rapport à l’électrophysiologie traditionnelle en capturant à la fois la morphologie et les activités dynamiques des neurones, facilitant ainsi le suivi à long terme des neurones identifiés 5,6,7,8.
Malgré ses atouts notables, l’application de l’imagerie par fluorescence à haute résolution nécessite souvent une configuration statique et fixe à la tête qui limite la mobilité de l’animal 9,10,11. De plus, l’utilisation d’une surface en verre transparent pour visualiser les neurones restreint les observations à un ou plusieurs plans horizontaux, limitant ainsi l’exploration de la dynamique des processus verticaux qui s’étendent sur différentes profondeurs corticales12.
En remédiant à ces limitations, la présente étude décrit une procédure chirurgicale innovante qui intègre la fixation de la plaque de tête, le microprisme et le miniscope pour créer une modalité d’imagerie avec des capacités multicouches et multimodales. Le microprisme permet d’observer le traitement vertical le long de la colonne corticale 13,14,15,16, ce qui est essentiel pour comprendre comment l’information est traitée et transformée lorsqu’elle se déplace à travers différentes couches du cortex et comment le traitement vertical est modifié lors des changements plastiques. De plus, il permet d’imager les mêmes populations neuronales dans un paradigme de tête fixe et dans un cadre en mouvement libre, englobant les cadres expérimentaux polyvalents 17,18,19 : par exemple, la fixation de la tête est souvent nécessaire pour des paradigmes bien contrôlés comme l’évaluation de la perception sensorielle et les enregistrements stables sous le paradigme à 2 photons, tandis que le mouvement libre offre un environnement plus naturel et plus flexible pour les études comportementales. Par conséquent, la capacité d’effectuer une comparaison directe dans les deux modes est cruciale pour approfondir notre compréhension des microcircuits qui permettent des réponses flexibles et fonctionnelles.
Essentiellement, l’intégration de la fixation de la plaque frontale, du microprisme et du miniscope dans l’imagerie de fluorescence offre une plate-forme prometteuse pour sonder les subtilités de la structure et de la fonctionnalité du cerveau. Les chercheurs peuvent échantillonner des populations cellulaires identifiées à différentes profondeurs couvrant toutes les couches corticales, comparer directement leurs réponses dans des paradigmes bien contrôlés et naturels, et surveiller leurs altérations à long terme sur des mois20. Cette approche offre des informations précieuses sur la façon dont ces populations neuronales interagissent et changent au fil du temps dans différentes conditions expérimentales, offrant une fenêtre sur la nature dynamique des circuits neuronaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons montré la capacité d’observer et de comparer directement les neurones dans des conditions de tête fixe et de mouvement libre dans les mêmes populations neuronales. Bien que nous ayons démontré l’application dans le cortex visuel, ce protocole peut être adapté à une multitude d’autres zones du cerveau, à la fois les zones corticales et les noyaux profonds 24,25,26,27,28, ainsi que d’autres configurations d’acquisition de données et comportementales<s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Mme Charu Reddy et le professeur Matteo Carandini (Cortex Lab) pour leurs conseils sur le protocole chirurgical et le partage de souches de souris transgéniques. Nous remercions le Dr Norbert Hogrefe (Inscopix) pour ses conseils et son aide tout au long du développement de la chirurgie. Nous remercions Mme Andreea Aldea (Sun Lab) pour son aide dans la configuration chirurgicale et le traitement des données. Ce travail a été soutenu par la Moorfields Eye Charity.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Saline for hydration and drug reconsitution |
| 18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur | FST | 18004-18 | Drill bit |
| 1ml syringe | Terumo | MDSS01SE | 1ml syringe |
| 23G x 5/8 inch 6% LUER needle | Terumo | NN-2316R | 23G needle |
| 71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software | RWD | – | RWD |
| Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | gel-foam |
| Alcohol pads 70% isopropyl alcohol | Braun | 9160612 | Alcohol pads |
| Aluminium foil | Any retailer | – | Foil to cover eyes during surgery |
| Articifical Cerebrospinal Fluid | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
| Automated microinjection pump | WPI | 8091 | |
| Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
| Bruker Ultime 2Pplus (customised) | Bruker | – | Two-photon imaging system |
| Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Anaesthesia absorber |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x objective lens |
| Compact Anaesthesia system – single gas – isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit | Vet-Tech | AN001 | Compact anaesthesia system |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Disinfectant (hypochlorous acid) |
| Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | Dexamethasone |
| Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel | Fine Science Tools | 10055-12 | Knife for incisino of cortex |
| Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars | Stoelting | 51649 | Ear bar |
| Dummy microscope | Inscopix | Dummy microscope | To help with implantation |
| Ethanol (100%) | VWR | 40-1712-25 | Used to make 70% ethanol |
| Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | Gloves |
| Homeothermic Monitor 50-7222-F | Harvard Apparatus | 50-7222-F | Homeothermic monitoring system/heating pad |
| Image processing software | ImageJ | – | Image processing software |
| Inscopix Data Processing Software (IDPS) | Inscopix | – | One-photon calcium imaging processing software |
| Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Two-photon imaging laser |
| IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
| Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive | World Precision Intruments (WPI) | KWIK-SIL | Silicone adhesive |
| MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E | PROXXON | NO 28 515 | Handheld drill |
| nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package | Inscopix | – | One-photon Imaging system and software |
| ProView Implant Kit | Inscopix | ProView Implant Kit | Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment |
| ProView Prism Probe | Inscopix | 1050-002203 | Microprism lens |
| Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
| Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp | WPI | PZMTIII-AAC | Microscope |
| Super-Bond Universal kit, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhesive cement |
| Two-photon calcium image software | Suite2P | – | Two-photon calcium imaging processing software |
| Vapouriser | Vet-Tech | – | Isoflurane vapouriser |
| Xailin Lubricating Eye Ointment 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Ophthalmic ointment |
References
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