Langzeitbildgebung identifizierter neuronaler Populationen mit Mikroprismen bei frei beweglichen und kopffixierten Tieren
Summary
In Kombination mit einer Kopfplatte und einem optischen Design, das sowohl mit Einzel- als auch mit Zwei-Photonen-Mikroskopen kompatibel ist, bietet die Mikroprismenlinse einen erheblichen Vorteil bei der Messung neuronaler Reaktionen in einer vertikalen Säule unter verschiedenen Bedingungen, einschließlich gut kontrollierter Experimente in kopffesten Zuständen oder natürlicher Verhaltensaufgaben bei frei beweglichen Tieren.
Abstract
Mit dem Fortschritt der Multiphotonenmikroskopie und der molekularen Technologien entwickelt sich die Fluoreszenzbildgebung schnell zu einem leistungsstarken Ansatz zur Untersuchung der Struktur, Funktion und Plastizität lebender Hirngewebe. Im Vergleich zur herkömmlichen Elektrophysiologie kann die Fluoreszenzmikroskopie sowohl die neuronale Aktivität als auch die Morphologie der Zellen erfassen und so Langzeitaufnahmen der identifizierten Neuronenpopulationen mit Einzelzell- oder subzellulärer Auflösung ermöglichen. Hochauflösende Bildgebung erfordert jedoch typischerweise einen stabilen, kopffesten Aufbau, der die Bewegung des Tieres einschränkt, und die Herstellung einer flachen Oberfläche aus transparentem Glas ermöglicht die Visualisierung von Neuronen auf einer oder mehreren horizontalen Ebenen, ist jedoch bei der Untersuchung der vertikalen Prozesse, die über verschiedene Tiefen verlaufen, begrenzt. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Kombination einer Kopfplattenfixierung und eines Mikroprismas, das eine mehrschichtige und multimodale Bildgebung ermöglicht. Dieses chirurgische Präparat ermöglicht nicht nur den Zugang zur gesamten Säule des visuellen Kortex der Maus, sondern ermöglicht auch die Zwei-Photonen-Bildgebung in einer kopffesten Position und die Ein-Photonen-Bildgebung in einem frei beweglichen Paradigma. Mit diesem Ansatz kann man identifizierte Zellpopulationen über verschiedene kortikale Schichten hinweg beproben, ihre Reaktionen unter kopffesten und frei beweglichen Zuständen registrieren und die langfristigen Veränderungen über Monate hinweg verfolgen. Somit bietet diese Methode einen umfassenden Assay der Mikroschaltkreise, der einen direkten Vergleich neuronaler Aktivitäten ermöglicht, die durch gut kontrollierte Reize und unter einem natürlichen Verhaltensparadigma hervorgerufen werden.
Introduction
Das Aufkommen der In-vivo-Zwei-Photonen-Fluoreszenzbildgebung 1,2, die die neuen Technologien in optischen Systemen und genetisch veränderte Fluoreszenzindikatoren kombiniert, hat sich zu einer leistungsstarken Technik in den Neurowissenschaften entwickelt, um die komplizierte Struktur, Funktion und Plastizität im lebenden Gehirn zu untersuchen 3,4. Insbesondere bietet diese Bildgebungsmodalität einen beispiellosen Vorteil gegenüber der herkömmlichen Elektrophysiologie, indem sie sowohl die Morphologie als auch die dynamischen Aktivitäten von Neuronen erfasst und dadurch die Langzeitverfolgung identifizierter Neuronen erleichtert 5,6,7,8.
Trotz ihrer bemerkenswerten Stärken erfordert die Anwendung der hochauflösenden Fluoreszenzbildgebung oft einen statischen, am Kopf fixierten Aufbau, der die Mobilität des Tieres einschränkt 9,10,11. Darüber hinaus beschränkt die Verwendung einer transparenten Glasoberfläche zur Visualisierung von Neuronen die Beobachtungen auf eine oder mehrere horizontale Ebenen, was die Erforschung der Dynamik vertikaler Prozesse, die sich über verschiedene kortikale Tiefen erstrecken, einschränkt12.
Um diese Einschränkungen zu beheben, skizziert die vorliegende Studie ein innovatives chirurgisches Verfahren, das Kopfplattenfixierung, Mikroprisma und Miniskop integriert, um eine Bildgebungsmodalität mit mehrschichtigen und multimodalen Fähigkeiten zu schaffen. Das Mikroprisma ermöglicht die Beobachtung der vertikalen Verarbeitung entlang der kortikalen Säule 13,14,15,16, was entscheidend ist, um zu verstehen, wie Informationen verarbeitet und transformiert werden, wenn sie sich durch verschiedene Schichten des Kortex bewegen, und wie die vertikale Verarbeitung während plastischer Veränderungen verändert wird. Darüber hinaus ermöglicht es die Abbildung derselben neuronalen Populationen in einem kopffixierten Paradigma und in einer frei beweglichen Umgebung, die die vielseitigen experimentellen Einstellungen umfasst 17,18,19: Zum Beispiel ist die Kopffixierung oft für gut kontrollierte Paradigmen wie die Bewertung der Sinneswahrnehmung und stabile Aufzeichnungen unter dem 2-Photonen-Paradigma erforderlich, während die freie Bewegung eine natürlichere, flexiblere Umgebung für Verhaltensstudien bietet. Daher ist die Fähigkeit, einen direkten Vergleich in beiden Modi durchzuführen, entscheidend, um unser Verständnis der Mikroschaltungen zu verbessern, die flexible, funktionale Reaktionen ermöglichen.
Im Wesentlichen bietet die Integration von Kopfplattenfixierung, Mikroprisma und Miniskop in die Fluoreszenzbildgebung eine vielversprechende Plattform, um die Feinheiten der Struktur und Funktionalität des Gehirns zu untersuchen. Forscher können identifizierte Zellpopulationen über verschiedene Tiefen hinweg über alle kortikalen Schichten hinweg beproben, ihre Reaktionen sowohl in gut kontrollierten als auch in natürlichen Paradigmen direkt vergleichen und ihre langfristigen Veränderungen über Monate hinweg überwachen20. Dieser Ansatz bietet wertvolle Einblicke in die Interaktion und Veränderung dieser neuronalen Populationen im Laufe der Zeit unter verschiedenen experimentellen Bedingungen und bietet einen Einblick in die dynamische Natur neuronaler Schaltkreise.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir die Fähigkeit gezeigt, Neuronen unter kopffixierten und frei beweglichen Bedingungen in denselben neuronalen Populationen zu beobachten und direkt zu vergleichen. Während wir die Anwendung im visuellen Kortex demonstriert haben, kann dieses Protokoll an eine Vielzahl anderer Hirnareale angepasst werden, sowohl an kortikale Areale als auch an tiefe Kerne 24,25,26,27,28 sowie an andere Datenerfassungs- und Verhaltensaufbauten<sup class="…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Frau Charu Reddy und Professor Matteo Carandini (Cortex Lab) für ihre Ratschläge zum chirurgischen Protokoll und zum Austausch transgener Mausstämme. Wir danken Dr. Norbert Hogrefe (Inscopix) für seine Anleitung und Unterstützung bei der Entwicklung der Operation. Wir danken Frau Andreea Aldea (Sun Lab) für ihre Unterstützung bei der chirurgischen Einrichtung und Datenverarbeitung. Diese Arbeit wurde von der Moorfields Eye Charity unterstützt.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Saline for hydration and drug reconsitution |
| 18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur | FST | 18004-18 | Drill bit |
| 1ml syringe | Terumo | MDSS01SE | 1ml syringe |
| 23G x 5/8 inch 6% LUER needle | Terumo | NN-2316R | 23G needle |
| 71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software | RWD | – | RWD |
| Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | gel-foam |
| Alcohol pads 70% isopropyl alcohol | Braun | 9160612 | Alcohol pads |
| Aluminium foil | Any retailer | – | Foil to cover eyes during surgery |
| Articifical Cerebrospinal Fluid | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
| Automated microinjection pump | WPI | 8091 | |
| Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
| Bruker Ultime 2Pplus (customised) | Bruker | – | Two-photon imaging system |
| Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Anaesthesia absorber |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x objective lens |
| Compact Anaesthesia system – single gas – isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit | Vet-Tech | AN001 | Compact anaesthesia system |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Disinfectant (hypochlorous acid) |
| Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | Dexamethasone |
| Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel | Fine Science Tools | 10055-12 | Knife for incisino of cortex |
| Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars | Stoelting | 51649 | Ear bar |
| Dummy microscope | Inscopix | Dummy microscope | To help with implantation |
| Ethanol (100%) | VWR | 40-1712-25 | Used to make 70% ethanol |
| Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | Gloves |
| Homeothermic Monitor 50-7222-F | Harvard Apparatus | 50-7222-F | Homeothermic monitoring system/heating pad |
| Image processing software | ImageJ | – | Image processing software |
| Inscopix Data Processing Software (IDPS) | Inscopix | – | One-photon calcium imaging processing software |
| Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Two-photon imaging laser |
| IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
| Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive | World Precision Intruments (WPI) | KWIK-SIL | Silicone adhesive |
| MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E | PROXXON | NO 28 515 | Handheld drill |
| nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package | Inscopix | – | One-photon Imaging system and software |
| ProView Implant Kit | Inscopix | ProView Implant Kit | Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment |
| ProView Prism Probe | Inscopix | 1050-002203 | Microprism lens |
| Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
| Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp | WPI | PZMTIII-AAC | Microscope |
| Super-Bond Universal kit, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhesive cement |
| Two-photon calcium image software | Suite2P | – | Two-photon calcium imaging processing software |
| Vapouriser | Vet-Tech | – | Isoflurane vapouriser |
| Xailin Lubricating Eye Ointment 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Ophthalmic ointment |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Vaziri, A., Emiliani, V. Reshaping the optical dimension in optogenetics. Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 128-137 (2012).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Sun, Y. J., Sebastian Espinosa, J., Hoseini, M. S., Stryker, M. P. Experience-dependent structural plasticity at pre- and postsynaptic sites of layer 2/3 cells in developing visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21812-21820 (2019).
- Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Reid, R. C. Chronic cellular imaging of mouse visual cortex during operant behavior and passive viewing. Front Cell Neurosci. 4, 3 (2010).
- Sofroniew, N. J., Flickinger, D., King, J., Svoboda, K. A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging. Elife. 5, 14472 (2016).
- Puścian, A., Benisty, H., Higley, M. J. NMDAR-dependent emergence of behavioral representation in primary visual cortex. Cell Rep. 32 (4), 107970 (2020).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo. imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Seaton, G., et al. Dual-component structural plasticity mediated by αCaMKII autophosphorylation on basal dendrites of cortical layer 2/3 neurones. J Neurosci. 40 (11), 2228-2245 (2020).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
- Chia, T. H., Levene, M. J. Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging. J Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: Imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (52), 18739-18744 (2014).
- Buxhoeveden, D. P., Casanova, M. F. The minicolumn hypothesis in neuroscience. Brain. 125, 935-951 (2002).
- Chen, S., et al. Miniature fluorescence microscopy for imaging brain activity in freely-behaving animals. Neurosci Bull. 36 (10), 1182-1190 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. J Vis Exp. (124), e55579 (2017).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), 88678 (2014).
- Wekselblatt, J. B., Flister, E. D., Piscopo, D. M., Niell, C. M. Large-scale imaging of cortical dynamics during sensory perception and behavior. J Neurophysiol. 115 (6), 2852-2866 (2016).
- Pnevmatikakis, E. A., et al. Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of calcium imaging data. Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomed Opt Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
- Wenzel, M., Hamm, J. P., Peterka, D. S., Yuste, R. Reliable and elastic propagation of cortical seizures in. Cell Rep. 19 (13), 2681-2693 (2017).
- Heys, J. G., Rangarajan, K. V., Dombeck, D. A. The functional micro-organization of grid cells revealed by cellular-resolution imaging. Neuron. 84 (5), 1079-1090 (2014).
- Barson, D., Hamodi, A. S. Simultaneous mesoscopic and two-photon imaging of neuronal activity in cortical circuits. Nat Methods. 17 (1), 107-113 (2020).
- Paquelet, G. E., et al. Single-cell activity and network properties of dorsal raphe nucleus serotonin neurons during emotionally salient behaviors. Neuron. 110 (16), 2664-2679 (2022).
- Yang, Q., et al. Transparent microelectrode arrays integrated with microprisms for electrophysiology and simultaneous two-photon imaging across cortical layers. bioRxiv. , (2022).
- Priestley, J. B., Bowler, J. C., Rolotti, S. V., Fusi, S., Losonczy, A. Signatures of rapid plasticity in hippocampal CA1 representations during novel experiences. Neuron. 110 (12), 1978-1992 (2022).
- Zong, W., et al. Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging. Nat Methods. 18 (1), 46-49 (2021).
- Engelbrecht, C. J., et al. Ultra-compact fiber-optic two-photon microscope for functional fluorescence imaging in vivo. Opt Express. 16 (8), 5556-5564 (2008).
- Suzuki, M., Aru, J., Larkum, M. E. Double-μ Periscope, a tool for multilayer optical recordings, optogenetic stimulations or both. Elife. 10, 72894 (2021).
- Stibůrek, M., et al. 110 μm thin endo-microscope for deep-brain in vivo observations of neuronal connectivity, activity and blood flow dynamics. Nat Commun. 14 (1), 1897 (2023).
