Imaging a lungo termine di popolazioni neurali identificate utilizzando microprismi in animali che si muovono liberamente e fissano la testa
Summary
Se integrata con una piastra di testa e un design ottico compatibile con microscopi a singolo e due fotoni, la lente del microprisma presenta un vantaggio significativo nella misurazione delle risposte neurali in una colonna verticale in diverse condizioni, inclusi esperimenti ben controllati in stati di fissazione della testa o compiti comportamentali naturali in animali che si muovono liberamente.
Abstract
Con il progresso della microscopia multi-fotone e delle tecnologie molecolari, l’imaging a fluorescenza sta rapidamente crescendo fino a diventare un potente approccio per studiare la struttura, la funzione e la plasticità dei tessuti cerebrali viventi. Rispetto all’elettrofisiologia convenzionale, la microscopia a fluorescenza è in grado di catturare l’attività neurale e la morfologia delle cellule, consentendo registrazioni a lungo termine delle popolazioni di neuroni identificate a risoluzione singola o subcellulare. Tuttavia, l’imaging ad alta risoluzione richiede in genere una configurazione stabile e fissata sulla testa che limita il movimento dell’animale, e la preparazione di una superficie piana di vetro trasparente consente la visualizzazione dei neuroni su uno o più piani orizzontali, ma è limitata nello studio dei processi verticali che attraversano diverse profondità. Qui, descriviamo una procedura per combinare una fissazione della piastra di testa e un microprisma che fornisce immagini multistrato e multimodali. Questa preparazione chirurgica non solo dà accesso all’intera colonna della corteccia visiva del topo, ma consente l’imaging a due fotoni in una posizione fissa sulla testa e l’imaging a un fotone in un paradigma che si muove liberamente. Utilizzando questo approccio, è possibile campionare popolazioni cellulari identificate in diversi strati corticali, registrare le loro risposte in stati di testa fissa e in movimento libero e monitorare i cambiamenti a lungo termine nel corso dei mesi. Pertanto, questo metodo fornisce un saggio completo dei microcircuiti, consentendo il confronto diretto delle attività neurali evocate da stimoli ben controllati e secondo un paradigma comportamentale naturale.
Introduction
L’avvento dell’imaging fluorescente a due fotoni in vivo 1,2, che combina le nuove tecnologie nei sistemi ottici e gli indicatori di fluorescenza geneticamente modificati, è emerso come una potente tecnica nelle neuroscienze per studiare l’intricata struttura, funzione e plasticità nel cervello vivente 3,4. In particolare, questa modalità di imaging offre un vantaggio senza precedenti rispetto all’elettrofisiologia tradizionale, catturando sia la morfologia che le attività dinamiche dei neuroni, facilitando così il monitoraggio a lungo termine dei neuroni identificati 5,6,7,8.
Nonostante i suoi notevoli punti di forza, l’applicazione dell’imaging a fluorescenza ad alta risoluzione richiede spesso una configurazione statica e fissa sulla testa che limita la mobilità dell’animale 9,10,11. Inoltre, l’uso di una superficie di vetro trasparente per la visualizzazione dei neuroni restringe le osservazioni a uno o più piani orizzontali, limitando l’esplorazione della dinamica dei processi verticali che si estendono a diverse profondità corticali12.
Affrontando queste limitazioni, il presente studio delinea una procedura chirurgica innovativa che integra la fissazione della placca testale, il microprisma e il miniscopio per creare una modalità di imaging con capacità multistrato e multimodale. Il microprisma consente l’osservazione dell’elaborazione verticale lungo la colonna corticale 13,14,15,16, che è fondamentale per capire come l’informazione viene elaborata e trasformata mentre si muove attraverso i diversi strati della corteccia e come l’elaborazione verticale viene alterata durante i cambiamenti plastici. Inoltre, consente l’imaging delle stesse popolazioni neurali in un paradigma fissato alla testa e in un ambiente in movimento libero, comprendendo le versatili impostazioni sperimentali 17,18,19: ad esempio, la fissazione della testa è spesso richiesta per paradigmi ben controllati come la valutazione della percezione sensoriale e le registrazioni stabili sotto il paradigma a 2 fotoni, mentre il movimento libero offre un ambiente più naturale e flessibile per gli studi comportamentali. Pertanto, la capacità di condurre un confronto diretto in entrambe le modalità è fondamentale per approfondire la nostra comprensione dei microcircuiti che consentono risposte flessibili e funzionali.
In sostanza, l’integrazione della fissazione della placca testa, del microprisma e del miniscopio nell’imaging a fluorescenza offre una piattaforma promettente per sondare le complessità della struttura e della funzionalità del cervello. I ricercatori possono campionare le popolazioni cellulari identificate a varie profondità che coprono tutti gli strati corticali, confrontare direttamente le loro risposte in paradigmi sia ben controllati che naturali e monitorare le loro alterazioni a lungo termine per mesi20. Questo approccio offre preziose informazioni su come queste popolazioni neurali interagiscono e cambiano nel tempo in diverse condizioni sperimentali, fornendo una finestra sulla natura dinamica dei circuiti neurali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, abbiamo mostrato la capacità di osservare e confrontare direttamente i neuroni in condizioni di testa fissa e in movimento libero nelle stesse popolazioni neurali. Mentre abbiamo dimostrato l’applicazione nella corteccia visiva, questo protocollo può essere adattato a una moltitudine di altre aree cerebrali, sia aree corticali che nuclei profondi 24,25,26,27,28, così come altre acquisizioni di dati e configurazioni comportamentali <sup class="x…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la Sig.ra Charu Reddy e il Professor Matteo Carandini (Cortex Lab) per i loro consigli sul protocollo chirurgico e sulla condivisione del ceppo di topo transgenico. Ringraziamo il Dr. Norbert Hogrefe (Inscopix) per la sua guida e assistenza durante lo sviluppo dell’intervento. Ringraziamo la Sig.ra Andreea Aldea (Sun Lab) per la sua assistenza con la configurazione chirurgica e l’elaborazione dei dati. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Moorfields Eye Charity.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Saline for hydration and drug reconsitution |
| 18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur | FST | 18004-18 | Drill bit |
| 1ml syringe | Terumo | MDSS01SE | 1ml syringe |
| 23G x 5/8 inch 6% LUER needle | Terumo | NN-2316R | 23G needle |
| 71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software | RWD | – | RWD |
| Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | gel-foam |
| Alcohol pads 70% isopropyl alcohol | Braun | 9160612 | Alcohol pads |
| Aluminium foil | Any retailer | – | Foil to cover eyes during surgery |
| Articifical Cerebrospinal Fluid | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
| Automated microinjection pump | WPI | 8091 | |
| Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
| Bruker Ultime 2Pplus (customised) | Bruker | – | Two-photon imaging system |
| Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Anaesthesia absorber |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x objective lens |
| Compact Anaesthesia system – single gas – isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit | Vet-Tech | AN001 | Compact anaesthesia system |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Disinfectant (hypochlorous acid) |
| Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | Dexamethasone |
| Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel | Fine Science Tools | 10055-12 | Knife for incisino of cortex |
| Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars | Stoelting | 51649 | Ear bar |
| Dummy microscope | Inscopix | Dummy microscope | To help with implantation |
| Ethanol (100%) | VWR | 40-1712-25 | Used to make 70% ethanol |
| Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | Gloves |
| Homeothermic Monitor 50-7222-F | Harvard Apparatus | 50-7222-F | Homeothermic monitoring system/heating pad |
| Image processing software | ImageJ | – | Image processing software |
| Inscopix Data Processing Software (IDPS) | Inscopix | – | One-photon calcium imaging processing software |
| Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Two-photon imaging laser |
| IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
| Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive | World Precision Intruments (WPI) | KWIK-SIL | Silicone adhesive |
| MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E | PROXXON | NO 28 515 | Handheld drill |
| nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package | Inscopix | – | One-photon Imaging system and software |
| ProView Implant Kit | Inscopix | ProView Implant Kit | Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment |
| ProView Prism Probe | Inscopix | 1050-002203 | Microprism lens |
| Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
| Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp | WPI | PZMTIII-AAC | Microscope |
| Super-Bond Universal kit, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhesive cement |
| Two-photon calcium image software | Suite2P | – | Two-photon calcium imaging processing software |
| Vapouriser | Vet-Tech | – | Isoflurane vapouriser |
| Xailin Lubricating Eye Ointment 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Ophthalmic ointment |
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