Obtención de imágenes a largo plazo de poblaciones neuronales identificadas mediante microprismas en animales que se mueven libremente y con la cabeza fija
Summary
Cuando se integra con una placa de cabeza y un diseño óptico compatible con microscopios de uno y dos fotones, la lente de microprisma presenta una ventaja significativa en la medición de respuestas neuronales en una columna vertical en diversas condiciones, incluidos experimentos bien controlados en estados de cabeza fija o tareas de comportamiento natural en animales que se mueven libremente.
Abstract
Con el avance de la microscopía multifotónica y las tecnologías moleculares, las imágenes de fluorescencia están creciendo rápidamente para convertirse en un enfoque poderoso para estudiar la estructura, la función y la plasticidad de los tejidos cerebrales vivos. En comparación con la electrofisiología convencional, la microscopía de fluorescencia puede capturar la actividad neuronal, así como la morfología de las células, lo que permite registros a largo plazo de las poblaciones de neuronas identificadas con una resolución unicelular o subcelular. Sin embargo, las imágenes de alta resolución generalmente requieren una configuración estable y fija en la cabeza que restringe el movimiento del animal, y la preparación de una superficie plana de vidrio transparente permite la visualización de neuronas en uno o más planos horizontales, pero está limitada en el estudio de los procesos verticales que se ejecutan a diferentes profundidades. Aquí, describimos un procedimiento para combinar una fijación de la placa de la cabeza y un microprisma que proporciona imágenes multicapa y multimodal. Esta preparación quirúrgica no solo da acceso a toda la columna de la corteza visual del ratón, sino que permite obtener imágenes de dos fotones en una posición fija de la cabeza y obtener imágenes de un fotón en un paradigma de movimiento libre. Con este enfoque, se pueden muestrear poblaciones celulares identificadas en diferentes capas corticales, registrar sus respuestas en estados fijos y de movimiento libre, y realizar un seguimiento de los cambios a largo plazo durante meses. Por lo tanto, este método proporciona un ensayo completo de los microcircuitos, lo que permite la comparación directa de las actividades neuronales evocadas por estímulos bien controlados y bajo un paradigma de comportamiento natural.
Introduction
El advenimiento de las imágenes fluorescentes de dos fotones in vivo 1,2, que combinan las nuevas tecnologías en sistemas ópticos e indicadores de fluorescencia modificados genéticamente, ha surgido como una técnica poderosa en neurociencia para investigar la intrincada estructura, función y plasticidad en el cerebro vivo 3,4. En particular, esta modalidad de imagen ofrece una ventaja sin precedentes sobre la electrofisiología tradicional al capturar tanto la morfología como las actividades dinámicas de las neuronas, lo que facilita el seguimiento a largo plazo de las neuronas identificadas 5,6,7,8.
A pesar de sus notables fortalezas, la aplicación de imágenes de fluorescencia de alta resolución a menudo requiere una configuración estática fija de la cabeza que restringe la movilidad del animal 9,10,11. Además, el uso de una superficie de vidrio transparente para visualizar neuronas restringe las observaciones a uno o más planos horizontales, lo que limita la exploración de la dinámica de los procesos verticales que se extienden a través de diferentes profundidades corticales12.
Abordando estas limitaciones, el presente estudio describe un procedimiento quirúrgico innovador que integra la fijación de la placa de la cabeza, el microprisma y el miniscopio para crear una modalidad de imagen con capacidades multicapa y multimodal. El microprisma permite observar el procesamiento vertical a lo largo de la columna cortical 13,14,15,16, lo cual es fundamental para comprender cómo se procesa y transforma la información a medida que se mueve a través de las diferentes capas de la corteza y cómo se altera el procesamiento vertical durante los cambios plásticos. Además, permite obtener imágenes de las mismas poblaciones neuronales en un paradigma de fijación de la cabeza y en un entorno de movimiento libre, que abarca los versátiles entornos experimentales 17,18,19: por ejemplo, la fijación de la cabeza a menudo se requiere para paradigmas bien controlados como la evaluación de la percepción sensorial y los registros estables bajo el paradigma de 2 fotones, mientras que el movimiento libre ofrece un entorno más natural y flexible para los estudios del comportamiento. Por lo tanto, la capacidad de realizar una comparación directa en ambos modos es crucial para avanzar en nuestra comprensión de los microcircuitos que permiten respuestas flexibles y funcionales.
En esencia, la integración de la fijación de la placa de la cabeza, el microprisma y el miniscopio en las imágenes de fluorescencia ofrece una plataforma prometedora para sondear las complejidades de la estructura y funcionalidad del cerebro. Los investigadores pueden tomar muestras de poblaciones celulares identificadas a través de varias profundidades que abarcan todas las capas corticales, comparar directamente sus respuestas tanto en paradigmas bien controlados como naturales, y monitorear sus alteraciones a largo plazodurante meses. Este enfoque ofrece información valiosa sobre cómo estas poblaciones neuronales interactúan y cambian a lo largo del tiempo en diferentes condiciones experimentales, proporcionando una ventana a la naturaleza dinámica de los circuitos neuronales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, hemos demostrado la capacidad de observar y comparar directamente neuronas en condiciones de cabeza fija y movimiento libre en las mismas poblaciones neuronales. Si bien demostramos la aplicación en la corteza visual, este protocolo se puede adaptar a una multitud de otras áreas cerebrales, tanto áreas corticales como núcleos profundos 24,25,26,27,28, así como a otras configuraciones de adquisición de datos y comportamiento <sup class="xre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Sra. Charu Reddy y al Profesor Matteo Carandini (Cortex Lab) por sus consejos sobre el protocolo quirúrgico y el intercambio de cepas de ratones transgénicos. Agradecemos al Dr. Norbert Hogrefe (Inscopix) por su orientación y asistencia durante el desarrollo de la cirugía. Agradecemos a la Sra. Andreea Aldea (Sun Lab) por su ayuda con la configuración quirúrgica y el procesamiento de datos. Este trabajo fue apoyado por la organización benéfica Moorfields Eye.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Saline for hydration and drug reconsitution |
| 18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur | FST | 18004-18 | Drill bit |
| 1ml syringe | Terumo | MDSS01SE | 1ml syringe |
| 23G x 5/8 inch 6% LUER needle | Terumo | NN-2316R | 23G needle |
| 71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software | RWD | – | RWD |
| Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | gel-foam |
| Alcohol pads 70% isopropyl alcohol | Braun | 9160612 | Alcohol pads |
| Aluminium foil | Any retailer | – | Foil to cover eyes during surgery |
| Articifical Cerebrospinal Fluid | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
| Automated microinjection pump | WPI | 8091 | |
| Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
| Bruker Ultime 2Pplus (customised) | Bruker | – | Two-photon imaging system |
| Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Anaesthesia absorber |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x objective lens |
| Compact Anaesthesia system – single gas – isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit | Vet-Tech | AN001 | Compact anaesthesia system |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Disinfectant (hypochlorous acid) |
| Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | Dexamethasone |
| Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel | Fine Science Tools | 10055-12 | Knife for incisino of cortex |
| Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars | Stoelting | 51649 | Ear bar |
| Dummy microscope | Inscopix | Dummy microscope | To help with implantation |
| Ethanol (100%) | VWR | 40-1712-25 | Used to make 70% ethanol |
| Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | Gloves |
| Homeothermic Monitor 50-7222-F | Harvard Apparatus | 50-7222-F | Homeothermic monitoring system/heating pad |
| Image processing software | ImageJ | – | Image processing software |
| Inscopix Data Processing Software (IDPS) | Inscopix | – | One-photon calcium imaging processing software |
| Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Two-photon imaging laser |
| IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
| Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive | World Precision Intruments (WPI) | KWIK-SIL | Silicone adhesive |
| MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E | PROXXON | NO 28 515 | Handheld drill |
| nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package | Inscopix | – | One-photon Imaging system and software |
| ProView Implant Kit | Inscopix | ProView Implant Kit | Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment |
| ProView Prism Probe | Inscopix | 1050-002203 | Microprism lens |
| Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
| Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp | WPI | PZMTIII-AAC | Microscope |
| Super-Bond Universal kit, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhesive cement |
| Two-photon calcium image software | Suite2P | – | Two-photon calcium imaging processing software |
| Vapouriser | Vet-Tech | – | Isoflurane vapouriser |
| Xailin Lubricating Eye Ointment 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Ophthalmic ointment |
References
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