Långtidsavbildning av identifierade neurala populationer med hjälp av mikroprismor i fritt rörliga och huvudfixerade djur
Summary
När den integreras med en huvudplatta och en optisk design som är kompatibel med både en- och tvåfotonmikroskop, ger mikroprismalinsen en betydande fördel när det gäller att mäta neurala svar i en vertikal kolumn under olika förhållanden, inklusive välkontrollerade experiment i huvudfixerade tillstånd eller naturliga beteendeuppgifter hos fritt rörliga djur.
Abstract
Med utvecklingen av multifotonmikroskopi och molekylära tekniker växer fluorescensavbildning snabbt till att bli en kraftfull metod för att studera strukturen, funktionen och plasticiteten hos levande hjärnvävnader. I jämförelse med konventionell elektrofysiologi kan fluorescensmikroskopi fånga cellernas neurala aktivitet såväl som morfologi, vilket möjliggör långtidsregistreringar av de identifierade neuronpopulationerna med encellig eller subcellulär upplösning. Högupplöst avbildning kräver dock vanligtvis en stabil, huvudfixerad uppställning som begränsar djurets rörelse, och beredningen av en plan yta av genomskinligt glas möjliggör visualisering av neuroner i ett eller flera horisontella plan men är begränsad när det gäller att studera de vertikala processer som löper över olika djup. Här beskriver vi en procedur för att kombinera en huvudplattfixering och ett mikroprisma som ger flerskikts- och multimodal avbildning. Detta kirurgiska preparat ger inte bara tillgång till hela kolumnen i musens visuella cortex utan möjliggör tvåfotonavbildning i en huvudfixerad position och enfotonavbildning i ett fritt rörligt paradigm. Med hjälp av detta tillvägagångssätt kan man ta prover på identifierade cellpopulationer över olika kortikala lager, registrera deras svar under huvudfixerade och fritt rörliga tillstånd och spåra de långsiktiga förändringarna över månader. Således ger denna metod en omfattande analys av mikrokretsarna, vilket möjliggör direkt jämförelse av neurala aktiviteter som framkallas av välkontrollerade stimuli och under ett naturligt beteendeparadigm.
Introduction
Tillkomsten av in vivo tvåfotonfluorescerandeavbildning 1,2, som kombinerar den nya tekniken i optiska system och genetiskt modifierade fluorescensindikatorer, har visat sig vara en kraftfull teknik inom neurovetenskapen för att undersöka den intrikata strukturen, funktionen och plasticiteten i den levande hjärnan 3,4. I synnerhet erbjuder denna avbildningsmodalitet en oöverträffad fördel jämfört med traditionell elektrofysiologi genom att fånga både neuronernas morfologi och dynamiska aktiviteter, vilket underlättar långsiktig spårning av identifierade neuroner 5,6,7,8.
Trots dess anmärkningsvärda styrkor kräver tillämpningen av högupplöst fluorescensavbildning ofta en statisk, huvudfixerad inställning som begränsar djurets rörlighet 9,10,11. Dessutom begränsar användningen av en transparent glasyta för visualisering av neuroner observationer till ett eller flera horisontella plan, vilket begränsar utforskningen av dynamiken i vertikala processer som sträcker sig över olika kortikala djup12.
För att ta itu med dessa begränsningar beskriver den aktuella studien ett innovativt kirurgiskt ingrepp som integrerar fixering av huvudplattan, mikroprisma och miniskop för att skapa en avbildningsmodalitet med flerskikts- och multimodala funktioner. Mikroprismat gör det möjligt att observera den vertikala bearbetningen längs den kortikala kolonnen 13,14,15,16, vilket är avgörande för att förstå hur information bearbetas och omvandlas när den rör sig genom olika lager i cortex och hur den vertikala bearbetningen förändras under plastiska förändringar. Dessutom tillåter det avbildning av samma neurala populationer i ett huvudfixerat paradigm och i en fritt rörlig miljö, som omfattar de mångsidiga experimentella inställningarna 17,18,19: till exempel krävs ofta huvudfixering för välkontrollerade paradigm som sensorisk perceptionsbedömning och stabila inspelningar under 2-fotonparadigmet, medan fri rörelse erbjuder en mer naturlig, flexibel miljö för beteendestudier. Därför är förmågan att göra en direkt jämförelse i båda moden avgörande för att öka vår förståelse av de mikrokretsar som möjliggör flexibla, funktionella svar.
I huvudsak erbjuder integrationen av fixering av huvudplattan, mikroprisma och miniskop i fluorescensavbildning en lovande plattform för att undersöka komplexiteten i hjärnans struktur och funktionalitet. Forskare kan ta prover på identifierade cellpopulationer på olika djup som spänner över alla kortikala lager, direkt jämföra deras svar i både välkontrollerade och naturliga paradigm och övervaka deras långsiktiga förändringar under månader20. Detta tillvägagångssätt ger värdefull insikt i hur dessa neurala populationer interagerar och förändras över tid under olika experimentella förhållanden, vilket ger ett fönster till den dynamiska naturen hos neurala kretsar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här har vi visat förmågan att observera och direkt jämföra nervceller i huvudfixerade och fritt rörliga förhållanden i samma neurala populationer. Medan vi demonstrerade tillämpningen i den visuella cortex, kan detta protokoll anpassas till en mängd andra hjärnområden, både kortikala områden och djupa kärnor 24,25,26,27,28, såväl som andra datainsamlings- och beteendeinställningar</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Charu Reddy och professor Matteo Carandini (Cortex Lab) för deras råd om kirurgiska protokoll och delning av transgen musstam. Vi tackar Dr Norbert Hogrefe (Inscopix) för hans vägledning och hjälp genom utvecklingen av operationen. Vi tackar Andreea Aldea (Sun Lab) för hennes hjälp med den kirurgiska installationen och databehandlingen. Detta arbete stöddes av Moorfields Eye Charity.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Saline for hydration and drug reconsitution |
| 18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur | FST | 18004-18 | Drill bit |
| 1ml syringe | Terumo | MDSS01SE | 1ml syringe |
| 23G x 5/8 inch 6% LUER needle | Terumo | NN-2316R | 23G needle |
| 71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software | RWD | – | RWD |
| Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | gel-foam |
| Alcohol pads 70% isopropyl alcohol | Braun | 9160612 | Alcohol pads |
| Aluminium foil | Any retailer | – | Foil to cover eyes during surgery |
| Articifical Cerebrospinal Fluid | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
| Automated microinjection pump | WPI | 8091 | |
| Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
| Bruker Ultime 2Pplus (customised) | Bruker | – | Two-photon imaging system |
| Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Anaesthesia absorber |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x objective lens |
| Compact Anaesthesia system – single gas – isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit | Vet-Tech | AN001 | Compact anaesthesia system |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Disinfectant (hypochlorous acid) |
| Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | Dexamethasone |
| Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel | Fine Science Tools | 10055-12 | Knife for incisino of cortex |
| Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars | Stoelting | 51649 | Ear bar |
| Dummy microscope | Inscopix | Dummy microscope | To help with implantation |
| Ethanol (100%) | VWR | 40-1712-25 | Used to make 70% ethanol |
| Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | Gloves |
| Homeothermic Monitor 50-7222-F | Harvard Apparatus | 50-7222-F | Homeothermic monitoring system/heating pad |
| Image processing software | ImageJ | – | Image processing software |
| Inscopix Data Processing Software (IDPS) | Inscopix | – | One-photon calcium imaging processing software |
| Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Two-photon imaging laser |
| IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
| Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive | World Precision Intruments (WPI) | KWIK-SIL | Silicone adhesive |
| MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E | PROXXON | NO 28 515 | Handheld drill |
| nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package | Inscopix | – | One-photon Imaging system and software |
| ProView Implant Kit | Inscopix | ProView Implant Kit | Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment |
| ProView Prism Probe | Inscopix | 1050-002203 | Microprism lens |
| Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
| Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp | WPI | PZMTIII-AAC | Microscope |
| Super-Bond Universal kit, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhesive cement |
| Two-photon calcium image software | Suite2P | – | Two-photon calcium imaging processing software |
| Vapouriser | Vet-Tech | – | Isoflurane vapouriser |
| Xailin Lubricating Eye Ointment 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Ophthalmic ointment |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Vaziri, A., Emiliani, V. Reshaping the optical dimension in optogenetics. Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 128-137 (2012).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Sun, Y. J., Sebastian Espinosa, J., Hoseini, M. S., Stryker, M. P. Experience-dependent structural plasticity at pre- and postsynaptic sites of layer 2/3 cells in developing visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21812-21820 (2019).
- Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Reid, R. C. Chronic cellular imaging of mouse visual cortex during operant behavior and passive viewing. Front Cell Neurosci. 4, 3 (2010).
- Sofroniew, N. J., Flickinger, D., King, J., Svoboda, K. A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging. Elife. 5, 14472 (2016).
- Puścian, A., Benisty, H., Higley, M. J. NMDAR-dependent emergence of behavioral representation in primary visual cortex. Cell Rep. 32 (4), 107970 (2020).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo. imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Seaton, G., et al. Dual-component structural plasticity mediated by αCaMKII autophosphorylation on basal dendrites of cortical layer 2/3 neurones. J Neurosci. 40 (11), 2228-2245 (2020).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
- Chia, T. H., Levene, M. J. Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging. J Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: Imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (52), 18739-18744 (2014).
- Buxhoeveden, D. P., Casanova, M. F. The minicolumn hypothesis in neuroscience. Brain. 125, 935-951 (2002).
- Chen, S., et al. Miniature fluorescence microscopy for imaging brain activity in freely-behaving animals. Neurosci Bull. 36 (10), 1182-1190 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. J Vis Exp. (124), e55579 (2017).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), 88678 (2014).
- Wekselblatt, J. B., Flister, E. D., Piscopo, D. M., Niell, C. M. Large-scale imaging of cortical dynamics during sensory perception and behavior. J Neurophysiol. 115 (6), 2852-2866 (2016).
- Pnevmatikakis, E. A., et al. Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of calcium imaging data. Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomed Opt Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
- Wenzel, M., Hamm, J. P., Peterka, D. S., Yuste, R. Reliable and elastic propagation of cortical seizures in. Cell Rep. 19 (13), 2681-2693 (2017).
- Heys, J. G., Rangarajan, K. V., Dombeck, D. A. The functional micro-organization of grid cells revealed by cellular-resolution imaging. Neuron. 84 (5), 1079-1090 (2014).
- Barson, D., Hamodi, A. S. Simultaneous mesoscopic and two-photon imaging of neuronal activity in cortical circuits. Nat Methods. 17 (1), 107-113 (2020).
- Paquelet, G. E., et al. Single-cell activity and network properties of dorsal raphe nucleus serotonin neurons during emotionally salient behaviors. Neuron. 110 (16), 2664-2679 (2022).
- Yang, Q., et al. Transparent microelectrode arrays integrated with microprisms for electrophysiology and simultaneous two-photon imaging across cortical layers. bioRxiv. , (2022).
- Priestley, J. B., Bowler, J. C., Rolotti, S. V., Fusi, S., Losonczy, A. Signatures of rapid plasticity in hippocampal CA1 representations during novel experiences. Neuron. 110 (12), 1978-1992 (2022).
- Zong, W., et al. Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging. Nat Methods. 18 (1), 46-49 (2021).
- Engelbrecht, C. J., et al. Ultra-compact fiber-optic two-photon microscope for functional fluorescence imaging in vivo. Opt Express. 16 (8), 5556-5564 (2008).
- Suzuki, M., Aru, J., Larkum, M. E. Double-μ Periscope, a tool for multilayer optical recordings, optogenetic stimulations or both. Elife. 10, 72894 (2021).
- Stibůrek, M., et al. 110 μm thin endo-microscope for deep-brain in vivo observations of neuronal connectivity, activity and blood flow dynamics. Nat Commun. 14 (1), 1897 (2023).
