自由に動く動物と頭部固定動物におけるマイクロプリズムを用いた同定された神経集団の長期イメージング
Summary
マイクロプリズムレンズは、1光子顕微鏡と2光子顕微鏡の両方に対応したヘッドプレートと光学設計と一体化することで、頭部を固定した状態でのよく制御された実験や、自由に動く動物の自然な行動課題など、さまざまな条件下で垂直カラム内の神経応答を測定する上で大きな利点を発揮します。
Abstract
多光子顕微鏡と分子技術の進歩により、蛍光イメージングは急速に成長し、生きた脳組織の構造、機能、可塑性を研究するための強力なアプローチとなっています。従来の電気生理学と比較して、蛍光顕微鏡法は細胞の形態だけでなく神経活動も捉えることができ、同定されたニューロン集団を単一細胞または細胞内の分解能で長期間記録することができます。しかし、高解像度のイメージングには、通常、動物の動きを制限する安定した頭部固定セットアップが必要であり、透明なガラスの平らな表面を調製することで、1つ以上の水平面でニューロンを視覚化できますが、異なる深さを横断する垂直プロセスの研究には制限があります。ここでは、ヘッドプレート固定とマイクロプリズムを組み合わせて、多層およびマルチモーダルイメージングを行う手順について説明します。この外科的準備により、マウスの視覚野の柱全体にアクセスできるだけでなく、頭部固定位置での2光子イメージングと、自由に動くパラダイムでの1光子イメージングが可能になります。このアプローチを用いることで、異なる皮質層で同定された細胞集団をサンプリングし、頭を固定した状態で自由に動く状態での反応を記録し、数ヶ月にわたる長期的な変化を追跡することができます。したがって、この方法は、マイクロ回路の包括的なアッセイを提供し、適切に制御された刺激によって誘発された神経活動と自然な行動パラダイムの下での神経活動の直接比較を可能にします。
Introduction
光学系の新技術と遺伝子改変蛍光インジケーターを組み合わせたin vivo二光子蛍光イメージング1,2の出現は、生きた脳の複雑な構造、機能、可塑性を研究するための神経科学における強力な技術として浮上しています3,4。.特に、このイメージングモダリティは、ニューロンの形態と動的活動の両方を捉えることにより、従来の電気生理学に比べて比類のない利点を提供し、それによって特定されたニューロンの長期的な追跡を容易にします5,6,7,8。
その注目すべき長所にもかかわらず、高解像度蛍光イメージングの適用は、動物の運動性を制限する静的な頭部固定セットアップを必要とすることがよくあります9,10,11。さらに、ニューロンを可視化するために透明なガラス表面を使用すると、観察が1つ以上の水平面に制限され、異なる皮質の深さにまたがって広がる垂直プロセスのダイナミクスの探索が制限されます12。
これらの制限に対処して、本研究では、ヘッドプレート固定、マイクロプリズム、およびミニスコープを統合して、多層およびマルチモーダル機能を備えたイメージングモダリティを作成する革新的な外科的手順の概要を説明します。マイクロプリズムは、皮質柱13,14,15,16に沿った垂直処理の観察を可能にし、これは、情報が皮質の異なる層を通過するときに情報がどのように処理され、変換されるか、およびプラスチック変化中に垂直処理がどのように変化するかを理解する上で重要である。さらに、それは、頭部固定パラダイムと自由に動く設定で、同じ神経集団のイメージングを可能にし、汎用性の高い実験設定17,18,19を包含します:例えば、頭部固定は、感覚知覚評価や2光子パラダイム下での安定した記録などの適切に制御されたパラダイムにしばしば必要であり、自由に動くことは、行動研究のためのより自然で柔軟な環境を提供します。したがって、両方のモードで直接比較を行う能力は、柔軟で機能的な応答を可能にするマイクロ回路の理解を深めるために重要です。
要するに、ヘッドプレート固定、マイクロプリズム、ミニスコープを蛍光イメージングに統合することで、脳の構造と機能の複雑さを精査するための有望なプラットフォームを提供するのです。研究者は、すべての皮質層にまたがるさまざまな深さで同定された細胞集団をサンプリングし、適切に制御されたパラダイムと自然なパラダイムの両方でそれらの応答を直接比較し、20か月にわたる長期的な変化を監視できます。このアプローチは、これらの神経集団がさまざまな実験条件下でどのように相互作用し、時間の経過とともに変化するかについての貴重な洞察を提供し、神経回路の動的な性質への窓を提供します。
Protocol
すべての実験は、1986年英国動物(科学的手順)法(UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986)に基づき、適切な倫理審査を経て英国内務省が承認・発行した個人ライセンスおよびプロジェクトライセンスの下で実施されました。成人トランスジェニック株CaMKII-TTA;GCaMP6S-TRE21 を育種し、その子孫を実験に用いた。実験者の安全と無菌状態の維持のために、すべての手順は無菌条件下で、完…
Representative Results
1光子と2光子の両方のイメージングモダリティを使用して、自由に動き、頭部を固定した条件下で、数週間にわたって同じニューロン集団の慢性多層in vivo カルシウムイメージングを実施する方法が示されています。ここでは、動物が暗闇の中でオープンアリーナを探索している間に、1光子イメージングの下で一致するニューロン集団を特定する能力が実証されました(?…
Discussion
本研究では、同じ神経集団において、頭部固定状態と自由に動く状態の神経細胞を観察し、直接比較できることを示しました。視覚野での応用を実証しましたが、このプロトコルは、皮質領域と深部核24,25,26,27,28、およびその他のデータ収集および行動セットアップ<sup c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Charu Reddy氏とMatteo Carandini教授(Cortex Lab)には、手術プロトコルとトランスジェニックマウス株の共有に関するアドバイスをいただき、感謝いたします。手術の開発を通じて指導と支援をしてくれたNorbert Hogrefe博士(Inscopix)に感謝します。Andreea Aldea 氏 (Sun Lab) には、手術のセットアップとデータ処理の支援に感謝します。この作業は、ムーアフィールズ・アイ・チャリティーの支援を受けました。
Materials
| 0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Saline for hydration and drug reconsitution |
| 18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur | FST | 18004-18 | Drill bit |
| 1ml syringe | Terumo | MDSS01SE | 1ml syringe |
| 23G x 5/8 inch 6% LUER needle | Terumo | NN-2316R | 23G needle |
| 71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software | RWD | – | RWD |
| Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | gel-foam |
| Alcohol pads 70% isopropyl alcohol | Braun | 9160612 | Alcohol pads |
| Aluminium foil | Any retailer | – | Foil to cover eyes during surgery |
| Articifical Cerebrospinal Fluid | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
| Automated microinjection pump | WPI | 8091 | |
| Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
| Bruker Ultime 2Pplus (customised) | Bruker | – | Two-photon imaging system |
| Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Anaesthesia absorber |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x objective lens |
| Compact Anaesthesia system – single gas – isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit | Vet-Tech | AN001 | Compact anaesthesia system |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Disinfectant (hypochlorous acid) |
| Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | Dexamethasone |
| Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel | Fine Science Tools | 10055-12 | Knife for incisino of cortex |
| Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars | Stoelting | 51649 | Ear bar |
| Dummy microscope | Inscopix | Dummy microscope | To help with implantation |
| Ethanol (100%) | VWR | 40-1712-25 | Used to make 70% ethanol |
| Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | Gloves |
| Homeothermic Monitor 50-7222-F | Harvard Apparatus | 50-7222-F | Homeothermic monitoring system/heating pad |
| Image processing software | ImageJ | – | Image processing software |
| Inscopix Data Processing Software (IDPS) | Inscopix | – | One-photon calcium imaging processing software |
| Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Two-photon imaging laser |
| IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
| Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive | World Precision Intruments (WPI) | KWIK-SIL | Silicone adhesive |
| MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E | PROXXON | NO 28 515 | Handheld drill |
| nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package | Inscopix | – | One-photon Imaging system and software |
| ProView Implant Kit | Inscopix | ProView Implant Kit | Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment |
| ProView Prism Probe | Inscopix | 1050-002203 | Microprism lens |
| Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
| Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp | WPI | PZMTIII-AAC | Microscope |
| Super-Bond Universal kit, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhesive cement |
| Two-photon calcium image software | Suite2P | – | Two-photon calcium imaging processing software |
| Vapouriser | Vet-Tech | – | Isoflurane vapouriser |
| Xailin Lubricating Eye Ointment 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Ophthalmic ointment |
References
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Citer Cet Article
Burrows, R., Ma, C., Sun, Y. J. Long-Term Imaging of Identified Neural Populations using Microprisms in Freely Moving and Head-Fixed Animals. J. Vis. Exp. (203), e65387, doi:10.3791/65387 (2024).