जीवित ऊतक का वास्तविक समय विश्लेषण महत्वपूर्ण कार्यात्मक और यंत्रवत डेटा उत्पन्न करता है। यह पेपर एक नए और पंप-मुक्त मल्टी-चैनल फ्लुइडिक्स सिस्टम द्वारा डेटा की सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पीढ़ी सुनिश्चित करने के लिए प्रोटोकॉल और महत्वपूर्ण चर का वर्णन करता है जो ऊतक और सेल मॉडल की एक विस्तृत श्रृंखला को बनाए रखता है और मूल्यांकन करता है।
ऊतक समारोह और कोशिका जीव विज्ञान की जांच के लिए उपयोग किए जाने वाले कई इन विट्रो मॉडल को फ़ंक्शन और व्यवहार्यता के रखरखाव के लिए आवश्यक पर्याप्त ऑक्सीजन और इष्टतम सेल स्थितियों को प्रदान करने के लिए मीडिया के प्रवाह की आवश्यकता होती है। इस अंत में, हमने संस्कृति में ऊतक और कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए एक बहु-चैनल प्रवाह संस्कृति प्रणाली विकसित की है और इन-लाइन सेंसर और / या बहिर्वाह अंशों के संग्रह द्वारा कार्य और व्यवहार्यता का लगातार आकलन किया है। यह प्रणाली मेटाबोलाइट्स और हार्मोन स्राव की उत्पादन दर को एक साथ मापने के लिए एक अंतर्निहित अंश कलेक्टर के साथ ऑक्सीजन खपत दर के 8-चैनल, निरंतर ऑप्टिकल सेंसिंग को जोड़ती है। यद्यपि यह आइलेट्स, मांसपेशियों और हाइपोथैलेमस सहित ऊतक और सेल मॉडल की एक विस्तृत श्रृंखला को बनाए रखने और आकलन करने में सक्षम है, यहां हम इसके ऑपरेटिंग सिद्धांतों और प्रयोगात्मक तैयारी / प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिनका उपयोग हमने पृथक माउस रेटिना, माउस रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) -कोरॉयड-स्क्लेरा और सुसंस्कृत मानव आरपीई कोशिकाओं के बायोएनर्जेटिक विनियमन की जांच करने के लिए किया है। सिस्टम के डिजाइन में नवाचार, जैसे कि पंपलेस द्रव प्रवाह, ने एक बहु-चैनल प्रवाह प्रणाली के बहुत सरल संचालन का उत्पादन किया है। वीडियो और चित्र दिखाए जाते हैं जो बताते हैं कि कैसे इकट्ठा किया जाए, एक प्रयोग के लिए उपकरण तैयार किया जाए, और विभिन्न ऊतक / सेल मॉडल को पेरिफ्यूजन कक्षों में लोड किया जाए। इसके अलावा, प्रोटोकॉल- और ऊतक-विशिष्ट प्रयोगों के लिए शर्तों का चयन करने के लिए दिशानिर्देश चित्रित और चर्चा किए जाते हैं, जिसमें सुसंगत और स्थिर संस्कृति स्थितियों और खपत और उत्पादन दरों के सटीक निर्धारण प्राप्त करने के लिए ऊतक अनुपात में सही प्रवाह दर निर्धारित करना शामिल है। इष्टतम ऊतक रखरखाव और कई मापदंडों के वास्तविक समय के मूल्यांकन का संयोजन अत्यधिक सूचनात्मक डेटा सेट उत्पन्न करता है जो आंख के शरीर विज्ञान में अनुसंधान और बिगड़ा हुआ दृष्टि के उपचार के लिए दवा की खोज के लिए बहुत उपयोगिता होगी।
पेरिफ्यूजन सिस्टम का जीवन विज्ञान में एक लंबा इतिहास है। विशेष रूप से, आइलेट्स द्वारा स्रावी कार्य के अध्ययन के लिए, उनका उपयोग स्रावित 1 के जवाब में इंसुलिन स्रावके कैनेटीक्स को चिह्नित करने के लिए किया गया है। हार्मोन और मेटाबोलाइट्स के बाद के परख के लिए बहिर्वाह अंशों को इकट्ठा करने के अलावा, वास्तविक समय सेंसर को शामिल किया गया है, मुख्य रूप से ऑक्सीजन की खपतका पता लगाने के लिए 2,3,4। आंखों के रोगों की मध्यस्थता करने वाले तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए व्यापक प्रयास रेटिना, रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) -कोरॉयड-श्वेतपटल और सुसंस्कृत आरपीई कोशिकाओं सहित आंख के विभिन्न पृथक घटकों के चयापचय विनियमन और विकृति का आकलन करने के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक तरीकों की कमी से सीमित हैं। सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए डिज़ाइन किए गए स्थैतिक प्रणालियों को ऊतक5 के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन ऊतक को पर्याप्त ऑक्सीजन के लिए प्रवाह की आवश्यकता होती है। फ्लो सिस्टम रेटिना और आरपीई-कोरॉइड-स्क्लेरा द्वारा ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) में वास्तविक समय की प्रतिक्रियाओं को सटीक और पुन: मापने में सफल रहे हैं, और ऊतक 8 घंटे से अधिक समय तक चयापचय रूप से स्थिर रहते हैं, जिससे कई परीक्षण यौगिकों 4,6,7,8,9 से जुड़े अत्यधिक सूचनात्मक प्रोटोकॉल की अनुमति मिलती है।. बहरहाल, फ्लुइडिक्स सिस्टम के संचालन के लिए ऐतिहासिक रूप से एक कस्टम-निर्मित उपकरण और गैर-मानकीकृत पद्धतियों में प्रशिक्षित तकनीकी कर्मचारियों की आवश्यकता होती है। ऐसी प्रणालियों को अधिकांश प्रयोगशालाओं में मानक पद्धति के रूप में नहीं अपनाया गया है। बैरोफ्यूज एक नव विकसित तरल पदार्थ प्रणाली है जो पंपों पर निर्भर नहीं करती है, बल्कि कई चैनलों और ऊतक कक्षों के माध्यम से प्रवाह को चलाने के लिए गैस के दबाव पर निर्भर करती है (चित्रा 1)। प्रत्येक चैनल को ओसीआर के लिए लगातार निगरानी की जाती है, और सामग्री के बाद के परख के लिए प्लेट-आधारित अंश कलेक्टर के साथ बहिर्वाह एकत्र किया जाता है। महत्वपूर्ण रूप से, उपकरण के लिए ऊतक पेरिफ्यूजन कक्ष ों को विभिन्न ज्यामिति और आकार के ऊतकों को समायोजित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
उपकरण का दिल फ्लुइडिक्स सिस्टम है, जहां प्रवाह को छोटे आंतरिक व्यास (आईडी) ट्यूबिंग (द्रव सर्किट में सबसे महत्वपूर्ण प्रवाह प्रतिरोध का योगदान) के माध्यम से एक सीलबंद, दबाव वाले जलाशय से ऊतक को रखने वाले कांच के ऊतक कक्षों में संचालित किया जाता है। मीडिया जलाशय मॉड्यूल (एमआरएम) को दबाव की आपूर्ति गैसों के मिश्रण (आमतौर पर 21% ओ 2, 5% सीओ 2, बैलेंस एन 2) वाले गैस सिलेंडर से जुड़े कम दबाव और उच्च दबाव नियामकों द्वारा की जाती है, और जलाशय को पेरिफ्यूजन चैंबर मॉड्यूल (पीसीएम) द्वारा शीर्ष से सील किया जाता है जो ऊतक कक्ष असेंबली (टीसीए) रखता है। प्रवाह दर प्रतिरोध ट्यूबों की लंबाई और आईडी और कम दबाव नियामक की दबाव सेटिंग द्वारा नियंत्रित की जाती है। ऊतक कक्षों के शीर्ष से जुड़े बहिर्वाह ट्यूब तरल पदार्थ को या तो अपशिष्ट रिसेप्टेक (जिसे प्रवाह दर के स्वचालित निर्धारण के लिए लगातार तौला जाता है) या अंश कलेक्टर द्वारा नियंत्रित 96-वेल प्लेट के कुओं में पहुंचाता है। ओ 2 डिटेक्शन सिस्टम ऊतक के डाउनस्ट्रीम ग्लास ऊतक कक्षों में से प्रत्येक के अंदर चित्रित ओ2-संवेदनशील डाई के जीवनकाल को मापता है। इस जानकारी का उपयोग लगातार ओसीआर की गणना करने के लिए किया जाता है। संपूर्ण तरल पदार्थ प्रणाली एक तापमान-नियंत्रित बाड़े में रहती है और गैस टैंक, अंश कलेक्टर और कंप्यूटर उपकरण के प्रमुख घटक हैं (चित्रा 2 ए)। अंत में, उपकरण चलाने वाला सॉफ्टवेयर इसके संचालन को नियंत्रित करने के लिए कार्य करता है (इंजेक्शन परीक्षण यौगिकों की तैयारी और समय, प्रवाह माप प्रणाली, और अंश कलेक्टर समय सहित), साथ ही ओसीआर डेटा और अन्य पूरक मापों को संसाधित और ग्राफ़ करना।
इस पेपर में हम आंख के विभिन्न पृथक घटकों के लिए ओसीआर और लैक्टेट उत्पादन दर (एलपीआर) का आकलन करने के लिए फ्लुइडिक्स सिस्टम का उपयोग करने के प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। एलपीआर ग्लाइकोलाइटिक दर को दर्शाने वाला एक पैरामीटर है जो ओसीआर के लिए अत्यधिक पूरक है, जहां जोड़ी सेल10 में कार्बोहाइड्रेट से ऊर्जा उत्पादन की दो प्रमुख शाखाओं के लिए जिम्मेदार है। चूंकि ऊतक की तैयारी और इसे ऊतक कक्षों में लोड करना प्रक्रिया को देखकर सबसे अच्छा सीखा जाता है, वीडियो सेट अप और ऑपरेशन के दौरान किए जाने वाले कई महत्वपूर्ण चरणों को चित्रित करने में मदद करेगा जो अकेले पाठ द्वारा आसानी से व्यक्त नहीं किए जाते हैं।
प्रोटोकॉल का विवरण 8 वर्गों में विभाजित है जो प्रयोग के विभिन्न चरणों के अनुरूप हैं (चित्रा 2 बी): 1. पूर्व-प्रयोगात्मक तैयारी; 2. पेरिफ्यूसेट की तैयारी / 3. उपकरण स्थापित; 4. ऊतक संतुलन; 5. प्रायोगिक प्रोटोकॉल; 6. उपकरण टूटना; 7. डेटा प्रोसेसिंग; और 8. बहिर्वाह अंशों का आकलन।
सेल फ़ंक्शन के सभी पहलुओं और आंख के विभिन्न घटकों के रखरखाव में बायोएनर्जेटिक के महत्व के कारण, इसके विनियमन का अध्ययन करने के तरीकों की महत्वपूर्ण आवश्यकता है। विशेष रूप से, तंत्रिका रेटिना और आरपीई ऊर्जा की पीढ़ी के साथ-साथ इंट्रा-और इंटर-सेलुलर सिग्नलिंग14,15,16,17 दोनों के लिए चयापचय पर निर्भर करते हैं। उनकी उच्च ऑक्सीडेटिव क्षमता के कारण, आंख के पृथक ऊतकों को स्थैतिक स्थितियों18,19 के तहत अच्छी तरह से बनाए नहीं रखा जाता है और इसलिए आंख के पृथक घटकों के अध्ययन के लिए प्रवाह प्रणालियों की आवश्यकता होती है जो चयापचय प्रक्रियाओं को बनाए रख सकते हैं और उनका आकलन कर सकते हैं। फ्लूडिक्स सिस्टम को ऊतक प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला से ओसीआर और एलपीआर डेटा उत्पन्न करने के लिए विकसित किया गया था और इस पेपर में हमने विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए जो इष्टतम परिणाम उत्पन्न करने के लिए पाए गए थे।
प्रवाह प्रणाली का उपयोग करके मजबूत डेटा उत्पन्न करने के लिए प्रमुख निर्धारक में 39 डिग्री सेल्सियस पर सीओ2-आधारित मीडिया / बफर का पूर्व-संतुलन शामिल है (यह सुनिश्चित करने के लिए कि पेरिफ्यूसेट भंग गैस से सुपरसैचुरेटेड नहीं है जो प्रयोग के दौरान विघटित हो जाएगा)। विशेष रूप से, 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत मीडिया या केआरबी बफर 37 डिग्री सेल्सियस के सापेक्ष सुपरसैचुरेटेड होगा और प्रयोग के दौरान डेगास होगा यदि पूर्व-संतुलन समय अपर्याप्त है। इसके अलावा, ऊतक कक्षों में लोड किए गए ऊतक को ऊतक के फटने या अपूर्ण पृथक्करण के कारण ऊतक के अनुचित अलगाव से आघात नहीं होना चाहिए, या बहुत लंबे समय तक वायुमंडलीय हवा में बाइकार्बोनेट-आधारित बफर की कम मात्रा में ऊतक को उजागर करके। तापमान नियंत्रण, प्रवाह स्थिरता और ओ2 डिटेक्शन की विश्वसनीयता में बहुत कम परिवर्तनशीलता है और ये कारक विफलता दर में महत्वपूर्ण योगदान नहीं देते हैं।
उपकरण में आठ प्रवाह चैनल / ऊतक कक्ष हैं जो एक साथ चलते हैं जिन्हें प्रत्येक जलाशय के लिए दो जलाशयों, चार ऊतक कक्षों से पेरिफ्यूसेट के साथ आपूर्ति की जाती है। ओसीआर के सबसे सटीक समय-पाठ्यक्रम प्राप्त करने के लिए, गतिज वक्रों को उन कक्षों द्वारा बेसलाइन सही किया जाता है जो ऊतक से भरे नहीं होते हैं। इस प्रकार, एक विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में तीन ऊतक कक्षों के दो समूह शामिल होंगे। सामान्य रूप से प्रोटोकॉल दो श्रेणियों में आते हैं: एक प्रत्येक तरफ अलग-अलग परीक्षण यौगिक प्रोटोकॉल है (उदाहरण के लिए एमआरएम के एक तरफ दवा / वाहन, और दूसरी तरफ सिर्फ वाहन); दूसरा एमआरएम के दोनों किनारों पर एक ही परीक्षण यौगिक इंजेक्शन प्रोटोकॉल है, लेकिन एमआरएम के प्रत्येक तरफ अलग-अलग ऊतक या ऊतक मॉडल है। इस पेपर में, रेटिना पर ऑलिगोमाइसिन और एफसीसीपी के प्रभावों की तुलना ऊतक द्वारा ओसीआर से की गई थी जो किसी भी परीक्षण यौगिकों के संपर्क में नहीं थे, और ऊतक-विशिष्ट व्यवहार की पहचान करने के लिए एक ही प्रोटोकॉल और शर्तों के तहत दो ऊतकों का सहवर्ती मूल्यांकन किया गया था। उत्तरार्द्ध को इस अध्ययन में एक ही प्रयोग में समानांतर में रेटिना के सापेक्ष आरपीई-कोरॉयड-स्क्लेरा द्वारा चयापचय दर की बढ़ी हुई गतिशील सीमा दिखाकर चित्रित किया गया था। अन्य रिपोर्टों ने अध्ययन डिजाइनों की एक विस्तृत श्रृंखला का वर्णन किया है जिसमें ओसीआर और एलपीआर पर ओ2 स्तरों के प्रभावों को मापना और ईंधन, दवाओं और विषाक्त पदार्थों की एकाग्रतानिर्भरता 20,21 शामिल है। इसके अलावा, हालांकि हमने बहिर्वाह अंशों के विश्लेषण को लैक्टेट के माप और एलपीआर की गणना तक सीमित कर दिया है, एक प्रयोग की सूचना सामग्री बहुत बढ़ जाती है यदि बहिर्वाह अंशों में कई यौगिकों और यौगिकों के वर्गों को हार्मोन, न्यूरोट्रांसमीटर, सेल सिग्नल और मेटाबोलाइट्स जैसे परख लिया जाता हैजो कोशिकाओं से बाहर निकल सकते हैं। 23.
पृथक रेटिना या आरपीई-कोरॉयड-स्क्लेरा का लोडिंग सीधा है, और एक बार अलग होने के बाद इन ऊतकों को केवल ऊतक कक्षों के शीर्ष पर बल के साथ रखा जाता है और फ्रिट तक डूबने की अनुमति दी जाती है। फिल्टर इंसर्ट पर संवर्धित आरपीई कोशिकाएं संस्कृति में 4-8 सप्ताह के बाद आरपीई परिपक्वता के उपयुक्त ध्रुवीकरण और मार्कर विकसित करती हैं। ट्रांसवेल झिल्ली से जुड़े होने के बाद लाइव सेल विश्लेषण के लिए आरपीई को हटाना संभव नहीं है, अगर आरपीई परिपक्वता और ध्रुवीकरणको बनाए रखा जाना है। पेरिफ्यूजन कक्ष ट्रांसवेल झिल्ली की स्ट्रिप्स को समायोजित कर सकता है जो एक स्केलपेल के साथ कट जाते हैं जबकि बफर में डूबे होते हैं और ऊतक कक्षों में तेजी से डाले जाते हैं। यद्यपि कटिंग फिल्टर स्ट्रिप्स को एक स्थिर प्रणाली24 में रखा गया है, इन महत्वपूर्ण सेल प्रकारों का आकलन करने के लिए कोई अन्य तरल पदार्थ विधि उपलब्ध नहीं है। आरपीई कोशिकाओं की प्रतिक्रियाएं रेटिना या आरपीई-कोरॉइड-स्क्लेरा की तुलना में तेजी से और अधिक गतिशील थीं, संभवतः झिल्ली डालने पर मोनोलेयर के रूप में कॉन्फ़िगर किए गए आरपीई कोशिकाओं के एपिकल और बेसल दोनों पहलुओं की तत्काल पहुंच के कारण।
डेटा को सुनिश्चित करने में एक और कारक शोर के लिए उच्चतम संकेत है, प्रवाह दर के सापेक्ष पेरिफ्यूजन कक्षों में लोड किए गए ऊतक के इष्टतम अनुपात का चयन कर रहा है। प्रवाह दर के सापेक्ष बहुत कम ऊतक के परिणामस्वरूप प्रवाह और बहिर्वाह के बीच घुलित ओ2 एकाग्रता का अंतर होता है जो बहुत छोटा होता है और मज़बूती से मापना मुश्किल होता है। इसके विपरीत, यदि प्रवाह बहुत धीमा है, तो ओ2 की एकाग्रता इतनी कम हो जाती है कि ऊतक हाइपोक्सिया से प्रभावित होता है। बहरहाल, गैस दबाव-संचालित तरल प्रवाह को 5 एमएल / मिनट तक प्रवाह दरों पर बनाए रखा जा सकता है, जिसमें सटीक ओसीआर और एलपीआर माप के लिए केवल थोड़ी मात्रा में ऊतक की आवश्यकता होती है। यहां दिखाए गए प्रयोगों में, लगभग 20 एमएल / मिनट / चैनल का उपयोग किया गया था जो या तो एक रेटिना, दो आरपीई-कोरॉयड-स्क्लेरस, या 360,000 आरपीई कोशिकाओं के लिए उपयुक्त था। सिस्टम प्रभावों को कम करने के लिए जो इंजेक्शन परीक्षण यौगिक के लिए ऊतक के जोखिम में देरी और फैलाव करते हैं, ऊतक कक्षों के कई आकारों की आपूर्ति की जाती है, ताकि ऊतक की मात्रा (और प्रवाह दर) कक्ष के उपयुक्त आकार के साथ मेल खाती है।
इस पेपर में दिखाए गए विश्लेषणों के डेटा को दो तरीकों से दर्शाया गया था: दर के संबंध में पूर्ण परिमाण, या स्थिर-राज्य या बेसलाइन के सापेक्ष आंशिक परिवर्तन। परीक्षण यौगिकों के लिए प्रतिक्रियाओं के माप के चित्रण पर ध्यान केंद्रित किया गया था। हालांकि, फ्लुइडिक्स सिस्टम पेरिफ्यूजन विश्लेषण जैसे आनुवंशिक संशोधनों से पहले ऊतक उपचार के प्रभावों का आकलन और तुलना करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। परीक्षण यौगिकों की सामान्यीकृत प्रतिक्रियाओं पर उपचार के प्रभावों का विश्लेषण किया जाता है तो परीक्षण करना कि क्या उपचार नियंत्रण से अलग है, सबसे मजबूत है। यदि विश्लेषण के लिए पूर्ण परिमाण की आवश्यकता होती है, तो पूर्वनिर्धारित नमूनों के विश्लेषण की सांख्यिकीय शक्ति को अधिकतम किया जाता है यदि उनका मूल्यांकन और नियंत्रण एक ही पेरिफ्यूजन प्रयोग में किया जाता है।
हलचल को छोड़कर, तरल के संपर्क में आने वाले सभी भागों को निर्माता द्वारा उपभोग्य सामग्रियों के रूप में आपूर्ति की जाती है और उन्हें निष्फल कर दिया गया है। इन भागों का पुन: उपयोग नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि अपूर्ण सफाई और दूषित सतहों के कारण प्रयोग कभी-कभी खो जाएंगे। सेटअप की शुरुआत में सिस्टम बाँझ है। हालांकि, मीडिया को एमआरएम में जोड़ा जाता है, और ऊतक को गैर-बाँझ परिस्थितियों में कक्षों में लोड किया जाता है। हमने उस प्रणाली में ओसीआर को मापा है जो बाँझ भागों के साथ इकट्ठा होता है, लेकिन जहां प्रयोग स्वयं गैर-बाँझ परिस्थितियों में किया जाता है। बैक्टीरिया को मापने योग्य ओसीआर (अप्रकाशित परिणाम) होने के बिंदु तक जमा होने में लगभग 14 घंटे लगते हैं। यदि प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है जो 10 घंटे या उससे कम है, तो बैक्टीरिया का संचय और इनके कारण कोई भी प्रभाव नगण्य होगा।
कई जांचकर्ता उन उपकरणों का उपयोग करते हैं जो अपेक्षाकृत उच्च थ्रूपुट25,26 के साथ कोशिकाओं के मोनोलेयर के स्थिर इनक्यूबेशन के तहत ओसीआर को मापने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। इसके विपरीत, इस पेपर में हमने जिस फ्लुइडिक्स उपकरण का परीक्षण और वर्णन किया है, वह पर्याप्त ओ2 डिलीवरी सुनिश्चित करके ऊतक को बनाए रखता है जो ऊतक नमूनों में मौजूद अधिक प्रसार दूरी के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, यह ओसीआर के समानांतर कई मापदंडों के मूल्यांकन की अनुमति देने वाले अंशों को इकट्ठा करने में सक्षम है जो उनके बीच संबंधों का अध्ययन करने की क्षमता को बढ़ाता है। अंत में, विघटित गैस सांद्रता (जैसे ओ 2 और सीओ 2) को नियंत्रित किया जा सकता है, जिससे बाइकार्बोनेट-आधारित मीडिया और बफर के साथ प्रयोगों की अवधि बढ़ जाती है, जिससे उपयोगकर्ता ओ2 के प्रभावों का अध्ययन कर सकता है। यह इंगित किया जाना चाहिए, दोनों पद्धतियों के लिए एक सीमा परीक्षण यौगिकों के वॉशआउट का अध्ययन करने में असमर्थता है, एक कार्यक्षमता जो अन्य पेरिफ्यूजन सिस्टम में 4,27,28 है। इष्टतम विश्लेषण पद्धति का निर्धारण करते समय एक और विचार यह तथ्य है कि फ्लुइडिक्स सिस्टम स्थिर प्रणालियों की तुलना में अधिक मीडिया और परीक्षण यौगिकों का उपयोग करते हैं। अतिरिक्त खर्च को वर्तमान फ्लुइडिक्स सिस्टम के साथ कम से कम किया जाता है, हालांकि कम प्रवाह दरों के कारण सिस्टम का उपयोग किया जा सकता है।
कुल मिलाकर, एक नए प्रवाह / मूल्यांकन उपकरण के साथ प्रयोग करने के लिए प्रोटोकॉल का विस्तृत विवरण वर्णित है। रेटिना और आरपीई-कोरॉइड-स्क्लेरा के साथ उत्पन्न डेटा ने उन प्रणालियों के साथ प्राप्त पिछले परिणामों को दोहराया जो उपयोग करने में अधिक कठिन हैं (और आसानी से उपलब्ध नहीं हैं)। यह भी प्रदर्शित किया गया था कि सिस्टम ट्रांसवेल झिल्ली से जुड़ी आरपीई कोशिकाओं को बनाए रख सकता है और उनका आकलन कर सकता है, एक बहुत ही महत्वपूर्ण सेलुलर मॉडल जिसे पहले कोशिकाओं की नाजुकता के कारण प्रवाह प्रणालियों के साथ विश्लेषण नहीं किया गया है। प्रोटोकॉल के मुख्य भागों में 75 मिनट का सेटअप समय होता है, इसके बाद 90 मिनट की अवधि और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल होता है जो इसे प्रयोगशालाओं द्वारा नियमित उपयोग के लिए उपयुक्त बनाता है जो फ्लुइडिक्स सिस्टम के संचालन में विशेषज्ञ नहीं हैं। यद्यपि हमने परीक्षण यौगिकों के लिए ऊतक की तीव्र प्रतिक्रिया को मापने पर ध्यान केंद्रित किया, सिस्टम विभिन्न स्रोतों जैसे पशु मॉडल या कोशिकाओं के मॉडल से ऊतक की तुलना करने के लिए बहुत उपयुक्त है जो आनुवंशिक रूप से बदल गए हैं या परीक्षण उपचार / शर्तों से गुजरे हैं। इसके अलावा, बहिर्वाह अंशों पर आयोजित किए जा सकने वाले परख का दायरा व्यापक है और इसमें मेटाबोलाइट्स, सेल सिग्नलिंग अणु और स्रावित हार्मोन / न्यूरोट्रांसमीटर के साथ-साथ अंशों के साथ-साथ ऊतक पर मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा उत्पन्न बहु-घटक विश्लेषण शामिल हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (आर01 GM148741 आई.आर.एस.), यू01 EY034591, आर01 EY034364, ब्राइटफोकस फाउंडेशन, रिसर्च टू प्रिवेंशन ब्लाइंडनेस (जे.आर.सी.) और आर01 EY006641, आर01 EY017863 और आर21 EY032597 (जे.बी.एच.) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
BIOLOGICAL SAMPLES | |||
C57BL/6J mice | Envigo Harlan (Indianapolis, IN) | N/A | |
REAGENTS | |||
FCCP | Sigma-Aldrich | C2920L9795 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270G | |
KCN | Sigma-Aldrich | 60178 | |
Lactate | MilliporeSigma | L6661 | |
Oliigomycin A | Sigma-Aldrich | 75351L9795 | |
CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING | |||
Beuthanasia-D | Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ | N/A | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbital | Virbac | RXEUTHASOL | |
Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | 12303C | |
Hank’s Buffered Salt Solution | GIBCO | 14065056 | |
Krebs Ringer Bicarbonate (KRB) | Thermo Fisher Scientific | J67795L9795 | |
Matrigel | ThermoFisher | #CB-40230 | |
Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
ROCKi | Selleck Chemicals | Y-27632 | |
Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25-200-072 | |
SUPPLIES | |||
Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2 | Praxair Distribution, Inc | N/A | |
Transwell filters | MilliporeSigma | 3470 | |
COMMERCIAL ASSAYS | |||
Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit | ThermoFisher | A22189 | |
Glucose Oxidase from Aerococcus viridans | Invitrogen (Carlsbad, CA) | A22189L9795 | |
Lactate Oxidase | Sigma-Aldrich | L9795 | |
EQUIPMENT | |||
BaroFuse Multi-Channel Perifusion system | EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA | Model 001-08 | |
Synergy 4 Fluorometer | BioTek (Winooski, VT) | S4MLFPTA |