Her presenterer vi en metode for å standardisere blodplateagonisten kollagenrelatert peptid tverrbundet (CRP-XL) ved hjelp av lystransmisjonsaggregometri. Mens protokollen er rettet mot blodplatefunksjon, kan den eksperimentelle prosessen brukes på de fleste biologiske molekyler og bioassays for å sikre vitenskapelig strenghet og reproduserbarhet.
Justervesenet – vitenskapen om mål – er et emne få biologiske forskere blir undervist om i sin utdanning til skade for dem; Anvendelsen av enkle standardiseringsprosesser i daglig arbeidspraksis gir tillit til data og reproduserbarhet over avstand og tid.
Denne metoden demonstrerer hvordan man standardiserer et kjernelaboratorieeksperiment som brukes mye i hemostaseforskning og klinisk praksis, spesielt måling av respons på blodplatekollagenreseptor (glykoprotein [GP] VI) agonist kollagenrelatert peptid, tverrbundet (CRP-XL) ved lystransmisjonsaggregometri (LTA). Bruk av denne tilnærmingen vil sikre reproduserbarhet i laboratoriet og harmonisering mellom laboratorier, uavhengig av agonistlager eller leverandør. Det er viktig at denne metoden gjelder for andre blodplateagonister og faktisk mange andre biologiske molekyler og bioassay.
Prosessen som er skissert nedenfor innebærer å lage en 6-8-punkts fortynningsserie av ‘standard’ og ‘testen’ (materialet du sjekker) og kjøre dem side om side i en valgt analyse (i dette tilfellet LTA). CRP-XL brukes ved masse/volumkonsentrasjoner, men ikke alle materialer gir samme biologiske aktivitet ved en gitt konsentrasjon, så en fortynningsserie er laget for å sammenligne standard- og testmaterialet og bestemme hvilken konsentrasjon som er nødvendig for å gi tilsvarende aktivitet. Fortynningsserien må spenne over 0-100% aggregering. Data plottes ved hjelp av ikke-lineær regresjon, og EF50-verdien for hver prøve (standard og test) bestemmes. For å tildele aktivitet, del EC50-verdien av standarden med testen for å bestemme hvor mye mer eller mindre potent den er og juster konsentrasjonen tilsvarende. Denne tilnærmingen vil sikre at den samme biologiske “aktiviteten” blir lagt til analysen gang på gang.
Mange av oss bruker biologiske agonister og antagonister i våre eksperimenter, oftest i en biologisk analyse som kvantifiserer deres effekt på cellefunksjon under spesifikke forhold. Metoden beskrevet her er for blodplateagonistens kollagenrelaterte peptid, kryssbundet (CRP-XL), en glykoprotein VI-agonist som aktiverer blodplater og hvis aktivitet kan måles i en rekke analyser (lystransmisjonsaggregometri, mikroskopi, flowcytometri, Ca2+ frigjøring, etc.), men agoniststandardiseringsprotokollen gjelder for enhver biologisk agonist / antagonist og / eller bioassay. Naturvitenskapene er velbevandret i bruk av standarder i deres daglige arbeidspraksis, og selskaper som utvikler bioterapeutiske medisiner i kommersiell sektor forstår verdien av å bruke referansestandarder1, men de forblir underutnyttet av mange biologiske forskere, spesielt i det akademiske forskningsmiljøet, og deres mangel på bruk påvirker kvaliteten på vitenskapelig produksjon negativt.
CRP-XL er en spesifikk GPVI-spesifikk agonist som blodplatefeltet har brukt i flere tiår siden beskrivelsen i 19952, og hjelper samfunnet til å avgrense rollen til GPVI fra andre kollagenbindende blodplateproteiner helt siden 3,4. Denne agonisten kan anskaffes fra en rekke kommersielle kilder eller produseres internt. Peptidmonomeren kan kjøpes fra en leverandør og deretter kryssbindes internt, eller dette kan gjøres av leverandøren mot en ekstra avgift. Ytterligere kostnadsbesparelser kan oppnås ved å redusere den nødvendige renheten ved levering (for eksempel 70% mot 95%). Det er heller ingen konsensus om hvordan CRP-XL skal lagres, med noen som velger kryolagring og andre kjøling, noen holder materialet lyofilisert til bruk, og andre lagrer det i oppløsning (vann eller buffer, avhengig av preferanse). Derfor er kvaliteten og sammensetningen av laboratoriebestandene ikke-standardisert eller harmonisert. Fordi denne agonisten brukes i en definert konsentrasjon (masse/volum) i stedet for aktivitetsenheter, vil styrken av CRP-XL i ett laboratorium, f.eks. ved 1 μg/ml, ikke være den samme som i et annet. Det er verdt å merke seg at andre blodplateagonister som brukes i felt allerede er standardiserte (f.eks. trombin, som leveres og brukes i aktivitetsenheter i stedet for masse / volum), så bevegelsen bort fra masse / volum til enheter av biologisk bør ikke være for utfordrende for samfunnet. Det bør også bemerkes at pasientrespons på blodplateagonister, inkludert CRP-XL, er variabel med hensyn til følsomhet overfor agonister samt deres evne til å respondere (grad av respons)5, så det er enda viktigere å bruke konsistente mengder agonistaktivitet i analysene.
Hvis blodplateagonister kan harmoniseres ved å bruke dem ved en definert aktivitet i stedet for vekt / volum, kan det sikres at et eksperiment i ett laboratorium er direkte sammenlignbart med det i andre laboratorier og kan reproduseres nøyaktig med tillit. Inntil feltet kommer til enighet om hvordan CRP-XL-aktivitet skal lagres og standardiseres, er det viktig å utføre regelmessige kontroller av materialet for å sikre konsistens i løpet av månedene/årene det brukes.
Aktivitetsverditildeling for biologiske standarder må gjøres gjennom samarbeidende, multisenterstudier (for eksempel 6,7) og krever spesialkompetanse. Behovet for etablerte biologiske standarder for blodplateagonister har nylig blitt fremhevet av en samarbeidende multisenterstudie8 støttet av International Society for Thrombosis and Haemostasis (ISTH); inntil en internasjonal CRP-XL-standard er tilgjengelig, kan forskere standardisere sitt eget materiale lokalt for å sikre konsistens over tid, og at nytt materiale hentet kommersielt eller internt er av sammenlignbar aktivitet med tidligere forberedelser, så vel som resten av samfunnet.
Som vist her, er prosessen med å standardisere materialene veldig grei. Selv om det krever litt tid å evaluere nye partier av materiale og / eller for å kontrollere at den nåværende batchen er stabil og ikke mister aktivitet over tid, er belønningen at eksperimenter er reproduserbare gang på gang og sammenlignbare over år i stedet for bare levetiden til en batch av reagens. Det betyr også at andre forskere nøyaktig kan gjenskape analyseforhold og at samfunnet er harmonisert på globalt nivå. Kritiske trinn i protokollen inkluderer fullblodsinnsamling og PRP-klargjøring9, samt presisjon ved utarbeidelse av fortynningsserien. Det er også viktig å sikre at test- og standardkurvene er parallelle før du fortsetter med EF50-sammenligningen . Hvis linjene ikke er parallelle, eller asymptotene ikke er ekvivalente, kan det indikere at testen og standardmaterialet er forskjellige til en viss grad.
Alle som jobber i biologiske vet at biologiske analyser ikke alltid utfører konsekvent, så man må være oppmerksom på dette når man vurderer dataene. I eksemplet vist her, selv om vi bruker de samme giverne til å måle styrken til to svært like, om ikke identiske, materialer, er bakkeskråningene og asymptotene ikke identiske. Likevel aksepterer vi en viss variasjon og konkluderer med at kurvene i dette tilfellet er parallelle, og derfor egnet til å sammenligne og justere potens. Biologiske molekyler er store og komplekse, og posttranslasjonelle modifikasjoner under produksjonen kan påvirke deres styrke i bioassay. Standardisering av biomolekyler og bioassays kan ikke gjøres ved bruk av bare masse eller volum og må gjøres ved å kvantifisere og sammenligne biologisk aktivitet i et bioassay11. Man må bruke sin opplæring og erfaring til å evaluere dataene i sammenheng med analysen.
Begrensninger av teknikken er at selv om dataene kan indikere et problem med reagensen (e), kan den ikke fortelle deg hva problemet er. Videre arbeid vil være nødvendig for å finne ut hvorfor materialene ikke er sammenlignbare. I en ideell verden ville ethvert materiale som er kritisk for eksperiment(er) og påfølgende vitenskapelige konklusjoner bli verifisert ved massespektroskopi, men dette er ikke alltid et alternativ. Men hvis dataene ikke er sammenlignbare, er ytterligere undersøkelser fortsatt berettiget i noen kapasitet. En annen begrensning av denne tilnærmingen er tiden og ressursene som trengs for å gjøre det. Ideelt sett bør testen og standarden sammenlignes hos 3-6 donorer for å gi en viss tillit til å tildele biologisk aktivitet til materialet, men vi føler at dette er berettiget ved å støtte reproduserbarhet og pålitelighet. Standardisering av biologisk materiale er ikke nødvendig hver gang eksperimenter kjøres, men som et minimum bør det gjøres for hvert nytt parti agonister, helst oftere, avhengig av stabilitet og bruk. Faktisk, hvis en standard blir gjort tilgjengelig, er dette noe som internasjonale standardiseringsorganisasjoner kan gi klarhet om.
Mens eksemplet vist her er for CRP-XL i sammenheng med måling av blodplateaggregering, er protokollen for å sammenligne den biologiske aktiviteten til biomolekyler i bioassays allment anvendelig over hele sektoren.
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
4% sodium citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | Anticoagulant dissolved in water9 |
4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | 54457 | |
CRP-XL | Peptide Protein Research Ltd. | A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd. | |
Cuvettes and stir bars | Stago | 86921 | Consumables for aggregometer |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M4880 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Prism | Graphpad | Analysis software package | |
Platelet rich plasma | Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8. |