Detta protokoll beskriver i detalj hur man bygger ett fluorescensmikroskop med ett enda objektiv och dess användning för att visualisera cytoskelettnätverk.
Rekonstituerade cytoskelettkompositer har visat sig vara ett värdefullt modellsystem för att studera mjuk materia som inte är i jämvikt. Den verklighetstrogna avbildningen av dynamiken i dessa 3D-täta nätverk kräver optisk snittning, som ofta förknippas med fluorescenskonfokalmikroskop. Den senaste utvecklingen inom fluorescensmikroskopi (LSFM) har dock etablerat det som ett kostnadseffektivt och ibland överlägset alternativ. För att göra LSFM tillgängligt för cytoskelettforskare som är mindre bekanta med optik presenterar vi en steg-för-steg-guide för nybörjare för att bygga ett mångsidigt fluorescensmikroskop av standardkomponenter. För att möjliggöra provmontering med traditionella objektsglasprover följer denna LSFM SOLS-designen (single-objective light-sheet), som använder ett enda objektiv för både excitations- och emissionsinsamlingen. Vi beskriver funktionen för varje komponent i SOLS tillräckligt detaljerat för att läsarna ska kunna modifiera instrumenteringen och designa den för att passa deras specifika behov. Slutligen demonstrerar vi användningen av detta anpassade SOLS-instrument genom att visualisera astrar i kinesindrivna mikrotubulinätverk.
Fluorescensmikroskopi (LSFM) är en familj av högupplösande fluorescensavbildningstekniker där excitationsljuset formas till ett ark 1,2, inklusive selektiv planbelysningsmikroskopi (SPIM), svept konfokalt inriktad plan excitation (SCAPE) och snedplanmikroskopi (OPM)3,4,5,6,7. Till skillnad från andra mikroskopimodaliteter som epi-fluorescens, total intern reflektionsfluorescensmikroskopi (TIRFM) eller konfokalmikroskopi, är fototoxiciteten minimal i LSFM och prover kan avbildas över längre tidsskalor eftersom endast planet för provet som avbildas aktivt belyses 8,9,10. Därför är LSFM-tekniker extremt användbara för att avbilda 3D-prover under längre tidsperioder, särskilt de som är för tjocka för konfokalmikroskopitekniker. På grund av dessa skäl har LSFM sedan sin ursprungliga utveckling 2004 blivit den avbildningsteknik som många fysiologer, utvecklingsbiologer och neuroforskare väljer för visualisering av hela organismer som levande zebrafiskar och Drosophila-embryon 3,4,6,11 . Under de senaste två decennierna har fördelarna med LSFM utnyttjats för att visualisera struktur och dynamik på progressivt mindre skalor, inklusive vävnad11,12, cellulär och subcellulär skala, både in vivo och in vitro13,14,15,17.
Trots rapporterna om framgångsrika användningsfall i litteraturen förhindrar den höga kostnaden för kommersiella LSFM-system (~0,25 miljoner USD i skrivande stund)18,19 en utbredd användning av tekniken. För att göra DIY-byggen till ett genomförbart alternativ för forskare har flera byggguider publicerats 8,13,20,21, inklusive open access-satsningen OpenSPIM 22. Hittills har dock forskare med minimal erfarenhet av optik endast kunnat använda tidigare LSFM-konstruktioner, som är inkompatibla med traditionella diabildsmonterade prover (figur 1A). I den senaste implementeringen av SOLS (single-objective light-sheet) används ett enda mål för både excitation och detektion (figur 1C), vilket övervinner begränsningen relaterad till kompatibilitet 5,6,8,13,20. Kostnaden för mångsidigheten i SOLS-designen är dock en betydande ökning av konstruktionens komplexitet på grund av kravet på ytterligare två objektiv för att vidarebefordra, luta och avbilda objektplanet på kameran för avbildning (figur 1D). För att underlätta åtkomsten till de komplexa SOLS-liknande uppställningarna presenterar detta dokument steg-för-steg-guide om design, konstruktion, inriktningsprocess och användning av ett glidkompatibelt SOLS-system, vilket skulle vara användbart för forskare med kunskap om endast en nybörjarkurs i optik.
Även om själva protokollet är kortfattat måste läsarna hänvisa till andra resurser under förberedelsestegen för att lära sig mer om särskilda delar av designen eller maskinvaruöverväganden. Men om en läsare har för avsikt att följa specifikationerna för denna design, kanske det inte är nödvändigt att förstå hur man väljer vissa optiska komponenter.
Figur 1: Egenskaper hos olika LSFM-konfigurationer. (A) Uppställningen med två ortogonala mål som är vanliga i tidiga LSFM-konstruktioner. I denna konfiguration används ett kapillärrör eller en cylinder av gel för att innesluta provet, vilket inte är kompatibelt med traditionella glidmonteringstekniker. B) En schematisk bild av en SOLS-konstruktion av lätta plåtar som visar följande: C) Det enda objektiv som används för både excitations- och emissionsinsamlingen vid provplanet (O1). detta gör att en traditionell rutschkana kan monteras ovanpå, och (D) relämålsystemet i SOLS-emissionsvägen. O2 samlar in emissionsljuset och avmagiserar bilden. O3 avbildar planet i rätt lutningsvinkel på kamerasensorn. Förkortningar: LSFM = light-sheet fluorescensmikroskopi; SOLS = ljusark med ett enda objektiv; O1-O3 = mål. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Två viktiga detaljer om det här protokollet är den totala kostnaden för systemet och den förväntade bygg- och justeringstiden. Även om den exakta kostnaden varierar, kan vi bekvämt uppskatta att kostnaden för denna SOLS eller ett liknande gör-det-själv-system skulle ligga i intervallet 85 000 USD. Vi noterar att denna uppskattning tar hänsyn till detaljhandelspriset för alla komponenter, så detta totala pris kan sänkas kraftigt genom att köpa begagnade komponenter. När det gäller byggtiden skulle det vara rimligt att förvänta sig att en användare med liten erfarenhet av optik ska bygga och justera hela detta SOLS-system inom 1-2 månader, förutsatt att alla komponenter är tillgängliga och klara. Trots protokollets längd och komplexitet anser vi att mängden detaljer i det skrivna manuskriptet, i kombination med videoprotokollet, bör göra detta protokoll enkelt och snabbt att följa.
Det finns två viktiga steg i det här protokollet. För det första bestämmer placeringen av galvo placeringen av många linser eftersom den är en del av tre separata 4f-linspar. Det är avgörande att galvoen både är konjugerad med de bakre fokalplanen för O1 och O2 och centrerad korrekt för att säkerställa lutningsinvariant skanning. För det andra är bildkvaliteten extremt känslig för inriktningen av O2 och O3 i förhållande till varandra. Här måste man se till att inriktningsvinkeln för O3 till O2 för det första matchar lutningen på excitationsljusarket, vilket ger maximalt platt belysning över den på samma sätt lutande FoV. För det andra måste O3 placeras på rätt axiellt avstånd för att bibehålla en platt FoV med så stor yta som möjligt. För det tredje måste O3 placeras på rätt sidoavstånd från O2 för att maximera signalen som passerar genom O2-O3-gränssnittet.
När det gäller användbar synfält uppnådde detta system ett platt, tillförlitligt fält med konsekvent belysning över ett område på 80 μm x 80 μm. Detta område är mindre än det maximala FoV som tillhandahålls av kameran, så den användbara FoV indikeras av den gula rutan i figur 13. När det gäller upplösningsförmågan uppnådde detta system ett minsta lösbart avstånd på 432 nm längs x-axeln och 421 nm längs y-axeln, vilket mättes genom att hitta det genomsnittliga sigma x och y för Gaussiska passningar till punktspridningsfunktioner (PSF) i bra FoV och multiplicera med två. Vi noterar att detta system inte var optimerat när det gäller dess totala NA, vilket innebär att det finns utrymme för betydande förbättringar om användarna önskar en upplösningsförmåga som är högre än vad detta system uppnådde. Det finns en mängd kompatibla målalternativ för denna typ av SOLS-bygge, av vilka många skulle bidra till en högre systemupplösning men med nackdelarna med en högre kostnad, en mindre FoV eller mer komplicerade inriktningstekniker vid relägränssnittet 8,11,13,20. Separat, om användare önskar en större FoV, skulle införlivande av en andra galvo för att möjliggöra 2D-skanning uppnå detta mål, men skulle kräva att ytterligare optik och kontrollmekanik integreras i designen32. Vi har tillhandahållit mer information om ändringar av systemet på vår webbplats, tillsammans med länkar till andra användbara resurser om designprocessen23.
Utöver att förbättra de specifika komponenterna för just denna design, skulle det vara mycket möjligt att lägga till andra högupplösta mikroskopitekniker eller modaliteter till denna konstruktion. En sådan förbättring skulle vara att införliva belysning med flera våglängder, vilket skulle innebära att ytterligare excitationslasrar anpassas till den ursprungliga excitationsvägen8. Dessutom, eftersom denna typ av SOLS-design lämnar provet tillgängligt, är det relativt enkelt att lägga till ytterligare funktioner till mikroskopet, inklusive men begränsat till optisk pincett, mikrofluidik och reometri.
Jämfört med de otaliga light-sheet-guider som har publicerats, ger detta protokoll instruktioner på en nivå av förståelse som en användare utan betydande optikerfarenhet kan ha nytta av. Genom att göra en användarvänlig SOLS-byggnad med traditionella provmonteringsmöjligheter tillgänglig för en större publik, hoppas vi kunna möjliggöra en ytterligare expansion av tillämpningarna av SOLS-baserad forskning inom alla områden där instrumentet har eller kan användas. Även med tillämpningar av SOLS-instrument som snabbt växer i antal 2,34,35, tror vi att många fördelar och användningsområden för instrument av SOLS-typ fortfarande är outforskade och uttrycker entusiasm över möjligheterna för denna typ av instrument framöver.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Science Foundation (NSF) RUI Award (DMR-2203791) till J.S. Vi är tacksamma för den vägledning som Dr. Bin Yang och Dr. Manish Kumar gav under anpassningsprocessen. Vi tackar Dr. Jenny Ross och K. Alice Lindsay för förberedelseinstruktionerna för kinesinmotorerna.
1" Plano-Concave Lens f = -50 mm | Thorlabs | LC1715-A-ML | For alignment laser Estimated Cost: $49.5 |
1" Achromatic Doublet f = 100 mm (x3) | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L2, L4 and alignment laser Estimated Cost: $342.42 |
1" Achromatic Doublet f = 125 mm | Thorlabs | AC254-125-A-ML | SL2 Estimated Cost: $114.14 |
1" Achromatic Doublet f = 150 mm | Thorlabs | AC254-150-A-ML | L3 Estimated Cost: $114.14 |
1" Achromatic Doublet f = 150 mm | Thorlabs | AC254-150-A-ML | TL2 Estimated Cost: $114.14 |
1" Achromatic Doublet f = 45 mm | Thorlabs | AC254-045-A-ML | L1 Estimated Cost: $114.14 |
1" Achromatic Doublet f = 75 mm | Thorlabs | AC254-075-A-ML | SL1 Estimated Cost: $114.14 |
1" Cylindrical Lens f = 100 mm | Thorlabs | LJ1567RM | CL3 Estimated Cost: $117.62 |
1" Cylindrical Lens f = 200 mm | Thorlabs | LJ1653RM | CL2 Estimated Cost: $111.22 |
1" Cylindrical Lens f = 50 mm | Thorlabs | LJ1695RM | CL1 Estimated Cost: $117.62 |
1" Mounted Pinhole, 30 µm Pinhole Diameter | Thorlabs | P30K | Estimated Cost: $77.08 |
1" Silver Mirror (x3) | Thorlabs | PF10-03-P01 | M1, M2, one for alignment Estimated Cost: $168.78 |
2" Elliptical Mirror | Thorlabs | PFE20-P01 | M3 Estimated Cost: $179.98 |
2" Post Holder (x11) | Thorlabs | PH2 | For custom laser mount, ND wheel, safety screens Estimated Cost: $98.45 |
2" Posts (x47) | Thorlabs | TR2 | For custom laser mount and optical components Estimated Cost: $277.3 |
3" Posts (x4) | Thorlabs | TR3 | For M3 supports and other mounts Estimated Cost: $24.6 |
3" Post Holder (x4) | Thorlabs | PH3 | Estimated Cost: $38.48 |
30 to 60 mm Cage Adapter | Thorlabs | LCP33 | To mount O1 Estimated Cost: $45.42 |
30mm Cage Filter Wheel | Thorlabs | CFW6 | To mount ND filters Estimated Cost: $172.36 |
30mm Cage Plate (x6) | Thorlabs | CP33 | To build alignment cage and alignment laser Estimated Cost: $114.54 |
30mm Right-Angle Kinematic Mirror Mount (x3) | Thorlabs | KCB1 | To mount M1 and M2 and for alignment laser Estimated Cost: $463.95 |
4" Post Holder (x30) | Thorlabs | PH4 | Estimated Cost: $320.1 |
561 nm Laser and Power Supply | Opto Engine LLC | MGL-FN-561-100mW | Excitation laser Estimated Cost: $6000 |
60mm Cage Plate (x2) | Thorlabs | LCP01 | To mount TL1 and M3 mount Estimated Cost: $88.52 |
60mm Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB2 | To mount M3 Estimated Cost: $187.26 |
90° Flip Mount | Thorlabs | TRF90 | For alignment laser Estimated Cost: $95.5 |
Adapter with External C-Mount Threads and Internal SM1 Threads | Thorlabs | SM1A9 | To connect lens tube to camera Estimated Cost: $20.96 |
Adapter with External SM1 Threads and Internal C-Mount Threads | Thorlabs | SM1A10 | To connect tube lens to lens mount Estimated Cost: $21.82 |
Adapter with External SM1 Threads and Internal M25 Threads (x2) | Thorlabs | SM1A12 | To mount O1 and O2 Estimated Cost: $47.06 |
Adapter with External SM1 Threads and Internal M26 Threads | Thorlabs | SM1A27 | To mount O3 Estimated Cost: $22.38 |
Alignment Disk | Thorlabs | SM1A7 | Estimated Cost: $20.45 |
Alignment Laser | BISKEE | https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM Estimated Cost: $16.98 |
|
Autoluorescent Plastic Slide, Red | Chroma | 92001 | Estimated Cost: $20 |
Beam Shutter | Thorlabs | SM1SH1 | To block laser light Estimated Cost: $65.8 |
Cage Rotation Mount (x3) | Thorlabs | CRM1T | To mount CL1-3 Estimated Cost: $282.15 |
Cage System Rods 1" (x8) | Thorlabs | ER1 | To mount M3 and O1 Estimated Cost: $44.8 |
Cage System Rods 3" (x2) | Thorlabs | ER3 | To mount O3 Estimated Cost: $14.28 |
Cage System Rods 4" (x4) | Thorlabs | ER4 | To mount slit Estimated Cost: $30.76 |
Cage System Rods 8" (x2) | Thorlabs | ER8 | For tube lens alignment Estimated Cost: $25.3 |
Cage System Rods 12" (x8) | Thorlabs | ER12 | For alignment cage Estimated Cost: $145.36 |
Camera | Andor | Zyla 4.2 sCMOS | Estimated Cost: ~$14,000 |
Clamping Fork (x35) | Thorlabs | CF125 | To clamp down post mounts Estimated Cost: $338.8 |
Cover Glass, 22 x 22 mm | Corning | 2850-22 | For slide samples Estimated Cost: $265 |
Dichroic | AVR | DI01-R405/488/561/635-25×36 | To split exciation/emission paths Estimated Cost: $965 |
Dovetail Translation Stage | Thorlabs | DT12 | To translate pinhole Estimated Cost: $90.55 |
Emission Filter | Thorlabs | FELHO600 | Estimated Cost: $140.99 |
Frosted Glass Alignment Disk (x2) | Thorlabs | DG10-1500-H1 | For alignment cage and intermediate plane Estimated Cost: $75.14 |
Function Generator | Hewlett-Packard | HP 33120A 15 MHz | To control galvo Estimated Cost: $900 |
Galvanometer – 1D Large Beam Diameter System | Thorlabs | GVS011 | Estimated Cost: $1715.78 |
Galvanometer Power Supply | Siglent | SPD3303C | Estimated Cost: $300 |
Gelrite | Research Products International | G35020-100.0 | Gellan gum for 3D bead sample Estimated Cost: $68.25 |
FIJI Software | Open-source | Download from https://imagej.net/software/fiji/downloads Estimated Cost: Free |
|
Hot Plate/ Stirrer | Corning | 6795-220 | For preparing sample solutions Estimated Cost: $550 |
K-Cube Brushed Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Drives Z825B Estimated Cost: $757.51 |
Kinematic Mount | Thorlabs | KM100S | To mount dichroic Estimated Cost: $92.01 |
Kinesis Software | Thorlabs | Download from https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 Estimated Cost: Free |
|
Laser Light Blocker | Thorlabs | LB1 | For ND filter reflections Estimated Cost: $57.65 |
Laser Mount | custom made | 3D printed Estimated Cost: N/A |
|
Laser Safety Screen (x2) | Thorlabs | TPS4 | For blocking stray laser light Estimated Cost: $92.02 |
Laser Scanning Tube Lens | Thorlabs | TTL200MP | TL1 Estimated Cost: $1491 |
Lens Mount (x10) | Thorlabs | LMR1 | To mount all lens and extra alignment mirror. Estimated Cost: $164.7 |
Magnetic Ruler | Thorlabs | BHM4 | To check alignment Estimated Cost: $52.74 |
Micro-Manager Software | Open-source | Download from https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release Estimated Cost: Free |
|
Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12550400 | For slide samples Estimated Cost: $123.9 |
Microscope Stage | ASI | FTP-2000 with custom parts | To fine-translate samples Estimated Cost: ~$16,000 |
Mini Vortex Mixer | VWR | 10153-688 | For sample preparation Estimated Cost: $152.64 |
Motorized Actuator | Thorlabs | Z825B | To fine-translate M1 Estimated Cost: $729.07 |
Mounted Standard Iris (x2) | Thorlabs | ID20 | At least 2 for alignment Estimated Cost: $118.02 |
ND Filter Set | Thorlabs | NDK01 | To reduce excitation intensity Estimated Cost: $726.73 |
Objective Lens 1 | Nikon | Plan Apo 60X/ 1.20 WI | O1 Estimated Cost: ~$15,000 |
Objective Lens 2 | Nikon | TU Plan Fluor 100X/0.90 | O2 Estimated Cost: ~$6,000 |
Objective Lens 3 | Mitutoyo | Plan Apo HR 50X/0.75 | O3 Estimated Cost: ~$6,800 |
OPM Deskewing Software | Open-source | For image processing. Download from https://github.com/QI2lab/OPM Estimated Cost: Free |
|
Photodiode Power Sensor | Thorlabs | S121C | For measuring laser intensity Estimated Cost: $379.68 |
Positive Grid Distortion Target | Thorlabs | R1L3S3P | Brightfield alignment Estimated Cost: $267.87 |
Power Meter Digital Console | Thorlabs | PM100D | For measuring laser intensity Estimated Cost: $1245.48 |
Rhodamine 6G | Thermo Scientific | J62315.14 | For fluorescent coated slide sample Estimated Cost: $27.7 |
Right-Angle Clamp for Posts | Thorlabs | RA90 | For M3 support and flip down mirror Estimated Cost: $32.46 |
RMS-Threaded Cage Plate (x2) | Thorlabs | CP42 | For alignment laser Estimated Cost: $70.56 |
Shear Plate 2.5-5.0 mm | Thorlabs | SI050P | Estimated Cost: $182.85 |
Shear Plate 5.0-10.0 mm | Thorlabs | SI100P | Estimated Cost: $201.47 |
Shear Plate 10.0-25.4 mm | Thorlabs | SI254P | Estimated Cost: $236.42 |
Shear Plate Viewing Screen | Thorlabs | SIVS | Estimated Cost: $337.74 |
Shearing Interferometer with 1-3 mm Plate | Thorlabs | SI035 | For checking collimation Estimated Cost: $465.85 |
Slip-On Post Collar (x35) | Thorlabs | R2 | To maintain post height Estimated Cost: $208.25 |
Slit | Thorlabs | VA100 | Estimated Cost: $294.64 |
Slotted Lens Tube, 3" | Thorlabs | SM1L30C | For alignment laser Estimated Cost: $77.45 |
Square Mirror, 1 x 1" | https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hva did=642191768069&hvpos=&hvne tw=g&hvrand=1336734911900437 4691&hvpone=&hvptwo=&hvqmt= &hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=& hvlocphy=9031212&hvtargid=pla-1 943952718742&gclid=Cj0KCQiA6L yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA Lw_wcB&th=1 Estimated Cost: $14.76 |
||
Stackable Lens Tube 1/2" (x3) | Thorlabs | SM1L05 | To mount CL1-3 Estimated Cost: $40.86 |
Stackable Lens Tube 1" | Thorlabs | SM1L10 | To mount O3 Estimated Cost: $15.41 |
Stackable Lens Tube 2" (x2) | Thorlabs | SM1L20 | For camera path Estimated Cost: $35.7 |
Studded Pedestal Base Adapter (x37) | Thorlabs | BE1 | To attach post mounts to table Estimated Cost: $400.71 |
Translating Lens Mount (x3) | Thorlabs | LM1XY | To fine-translate pinhole, O2 and O3 Estimated Cost: $441 |
Translation Stage with Standard Micrometer (x2) | Thorlabs | PT1/M | TS1-2 Estimated Cost: $647.54 |
Travel Manual Translation Stage | Thorlabs | CT1A | O3 cage translation mount Estimated Cost: $497.3 |
Tube Lens | Nikon | MXA20696 | TL3 Estimated Cost: $359 |
White Mounted LED | Thorlabs | MNWHL4 | Brightfield light source Estimated Cost: $171.28 |
TOTAL ESTIMATED COST: $84,858.98 | |||
The authors note that many parts were bought used. Here, we have attempted to reflect the retail price of all items, so the total cost can be greatly reduced by buying particular items used, especially the more expensive ones. | |||
OPTIONAL COMPONENTS | |||
Grasshopper3 USB3 | FLIR | GS3-U3-23S6C-C | For diagnostic checks during alignment. Acquisiton camera can be used instead, but requires realignment afterwards. Estimated Cost: $1089 |