En in vitro-model af knoglemarvsvaskulær niche etableres ved såning af mesenkymale og endotelceller på præfabrikerede 3D PEG-hydrogeler. Nichernes endotelnetværk, ECM-komponenter og ALP-aktivitet varierer afhængigt af den anvendte vækstfaktor. Platformen kan bruges til avancerede kræftmodeller.
Knogle og knoglemarv er stærkt vaskulariserede og strukturelt komplekse organer, og er steder for kræft og metastase dannelse. In vitro-modeller , der rekapitulerer knogle- og knoglemarvsspecifikke funktioner, herunder vaskularisering, der er kompatible med lægemiddelscreening, er meget ønskelige. Sådanne modeller kan bygge bro mellem forenklede, strukturelt irrelevante todimensionelle (2D) in vitro-modeller og de dyrere, etisk udfordrende in vivo-modeller . Denne artikel beskriver et kontrollerbart tredimensionelt (3D) cokulturassay baseret på konstruerede poly(ethylenglycol) (PEG) matricer til generering af vaskulariserede, osteogene knoglemarvsnicher. PEG-matrixdesignet muliggør udvikling af 3D-cellekulturer gennem et simpelt cellesåningstrin, der ikke kræver indkapsling, hvilket muliggør udvikling af komplekse samkultursystemer. Desuden er matricerne gennemsigtige og præfabrikerede på glasbundne 96-brønds billeddannelsesplader, hvilket gør systemet egnet til mikroskopi. Til analysen beskrevet her dyrkes humane knoglemarvsafledte mesenkymale stromale celler (hBM-MSC’er) først, indtil der dannes et tilstrækkeligt udviklet 3D-cellenetværk. Derefter tilsættes GFP-ekspressive humane navlestrengendotelceller (HUVEC’er). Kulturudviklingen efterfølges af lysfelt- og fluorescensmikroskopi. Tilstedeværelsen af hBM-MSC-netværket understøtter dannelsen af vaskulære strukturer, der ellers ikke ville dannes, og som forbliver stabile i mindst 7 dage. Omfanget af vaskulær netværksdannelse kan let kvantificeres. Denne model kan indstilles mod en osteogen knoglemarvsniche ved at supplere dyrkningsmediet med knoglemorfogenetisk protein 2 (BMP-2), som fremmer den osteogene differentiering af hBM-MSC’erne, vurderet ved øget alkalisk fosfatase (ALP) aktivitet på dag 4 og dag 7 af co-kultur. Denne cellulære model kan bruges som en platform til dyrkning af forskellige kræftceller og studere, hvordan de interagerer med knogle- og knoglemarvsspecifikke vaskulære nicher. Desuden er det velegnet til automatisering og analyser med højt indhold, hvilket betyder, at det ville muliggøre screening af kræftmedicin under meget reproducerbare dyrkningsforhold.
Knogle- og knoglemarven er strukturelt og funktionelt komplekse organer, der er centrale for menneskers sundhed. Dette afspejles af eksistensen af forskellige nicher, der regulerer hæmatopoiesis og knoglevedligeholdelse1. Det er nu almindeligt accepteret, at i sund knoglemarv styres vedligeholdelse og udvidelse af hæmatopoietiske og skeletale stamceller såvel som deres afkom af forskellige nicher. Disse nicher omfatter forskellige celletyper, herunder osteolineageceller, mesenkymale stamceller, endotel- og perivaskulære celler, neuronale og gliaceller, adipocytter, osteoklaster, makrofager og neutrofiler2. Ikke overraskende er disse for det meste vaskulaturassocierede nicher også involveret i udviklingen af forskellige typer leukæmi3 og er stedet for metastase for forskellige kræftformer4. På grund af dets specifikke roller i knogledannelse, ombygning og vedligeholdelse af knogler (marv) har den knogleassocierede vaskulatur forskellige specialiserede strukturer, der adskiller sig fra vaskulaturen, der findes andre steder i kroppen 5,6,7. Således kan antiangiogene eller vaskulaturmodulerende lægemidler, der anvendes systemisk, have forskellige virkninger inden for disse specialiserede miljøer8. Derfor er modeller til at undersøge de molekylære mekanismer, der er involveret i at opretholde knogler og knoglemarvs fysiologiske egenskaber, knogler og knoglemarvsregenerering og reaktioner på terapeutiske behandlinger meget ønskelige.
Klassiske todimensionelle (2D) vævskulturer og in vivo-undersøgelser ved hjælp af dyremodeller har givet uvurderlig indsigt i rollerne for forskellige celler og molekylære aktører, der er involveret i udviklingen af knogle- og knoglemarv 9,10. Modeller, der giver mulighed for high-throughput eksperimenter med relevante humane celler, kan forbedre vores forståelse af, hvordan man modulerer udvalgte parametre i disse meget komplekse systemer.
I det sidste årti er principper afledt af vævsteknik blevet anvendt til at generere 3D-vævsmodeller11,12. Disse har for det meste været afhængige af indkapsling af vævsrelevante celler i biomaterialer for at etablere 3D-mono- eller cokulturer13. Blandt de mest anvendte biomaterialer er fibrin14, kollagen 15 og Matrigel16,17, som alle er meget biokompatible og giver passende betingelser for vækst af mange celletyper. Disse biomaterialer har evnen til at generere in vitro-modeller, der rekapitulerer nøgleaspekter af de forskellige vaskulære nicher, der findes in vivo18. Desuden har brugen af mikrofluidiske anordninger til generering af perfunderede vaskulære knogle- og knoglemarvsmodeller bidraget til genereringen af in vitro-modeller med højere kompleksitet 19,20,21,22.
Vanskeligheden ved at kontrollere sammensætningen og konstruere egenskaberne af naturligt forekommende biomaterialer har inspireret udviklingen af syntetiske analoger, der rationelt kan designes med forudsigelige fysiske, kemiske og biologiske egenskaber23,24. Vi har udviklet fuldt syntetiske faktor XIII (FXIII) tværbundne poly (ethylenglycol) (PEG) -baserede hydrogeler, som er funktionaliseret med RGD-peptider og matrixmetalloprotease (MMP) spaltningssteder for at lette cellebinding og ombygning25,26. Det modulære design af disse biomaterialer er med succes blevet brugt til at optimere betingelserne for dannelsen af 3D vaskulariserede knogle- og knoglemarvsmodeller27,28.
Til test af et større antal forskellige dyrkningsforhold og nye behandlinger kræves modeller med en højere gennemstrømningskapacitet. Vi har for nylig vist, at FXIII-tværbindingen af vores PEG-hydrogel kan styres gennem en elektrokemisk proces, således at der dannes en dybtgående hydrogelstivhedsgradient29. Når celler tilsættes oven på sådanne hydrogeler, migrerer de mod det indre og udvikler sig gradvist til stærkt sammenkoblede 3D-cellulære netværk30. Afskaffelsen af behovet for at indkapsle celler i hydrogelen, som normalt er til stede med andre 3D-stilladser, forenkler ikke kun det eksperimentelle design, men tillader også sekventiel tilsætning af forskellige celletyper på forskellige tidspunkter for at generere komplekse samkultursystemer. Disse hydrogeler er tilgængelige præfabrikerede på glasbundne 96-brønds billeddannelsesplader, hvilket gør etableringen af 3D-kulturer opnåelig ved manuelle såvel som automatiserede cellesåningsprotokoller. Den optiske gennemsigtighed af PEG-hydrogelerne gør platformen kompatibel med mikroskopi.
Her præsenterer vi en ligetil metode til generering og karakterisering af vaskulariserede osteogene nicher inden for denne brugsklare, syntetiske plug-and-play-platform. Vi viser, at udviklingen af vaskulære netværk kan stimuleres med en vækstfaktor, der almindeligvis anvendes til at inducere in vitro osteogenese, knoglemorfogenetisk protein-2 (BMP-2), mens osteogen differentiering kan forhindres ved tilskud af fibroblastvækstfaktor 2 (FGF-2)27,31. De dannede netværk er forskellige sammenlignet med FGF-2-stimulerede netværk med hensyn til det overordnede udseende såvel som celle- og ECM-fordelingen. Desuden overvågede vi den osteogene induktion ved hjælp af alkalisk fosfatase som markør. Vi demonstrerer det øgede udtryk for denne markør over tid og sammenligner udtrykket med det i FGF-2-stimulerede netværk ved hjælp af kvalitative og kvantitative metoder. Endelig demonstrerer vi egnetheden af de genererede nicher i denne model til to potentielle applikationer. For det første udførte vi et proof-of-concept lægemiddelfølsomhedsassay ved at tilføje bevacizumab til præformede nicher og overvåge nedbrydningen af de vaskulære netværk i dets tilstedeværelse. For det andet tilføjede vi MDA-MB-231 brystkræft og U2OS osteosarkomceller til præformede osteogene nicher, hvilket viser, at nicherne kan bruges til at studere interaktioner mellem kræftceller og deres miljø.
Her beskriver vi en protokol for etablering af en in vitro-model af højvaskulariserede knogle- og knoglemarvsnicher i en fuldt syntetisk og kontrollerbar 3D PEG-baseret matrix, som har en række anvendelser inden for knogle- og knoglemarvsbiologiforskning, vævsteknik og kræftforskning. Denne model bygger på en syntetisk PEG-baseret hydrogel, der er funktionaliseret med RGD-peptider og MMP-spaltningssteder og er støbt med en dybdegående densitetsgradient på glasbundne 96-brønds billeddannelsesplader30. Denne plug-and-play-platform viste sig at tillade etablering af stærkt sammenkoblede 3D-cellulære netværk uden behov for at indkapsle celler i hydrogelen. I lighed med den tidligere beskrevne celleindkapslingsprotokol viser vi i dette arbejde ombygningen af substratet med en celleiboende ECM28 for at skabe et celletypespecifikt mikromiljø. Med denne metode kan lægemiddelscreeningsanalyser og analyser med højt indhold således let udføres under meget reproducerbare, organotypiske 3D-kulturbetingelser. Pladerne med 96 brønde med glasbund og de optisk gennemsigtige hydrogeler gør platformen kompatibel med automatisering af væskehåndtering og mikroskopi med høj kapacitet.
Det første skridt i genereringen af en osteogen vaskulær knoglemarvsniche er forkulturen af hBM-MSC’er på PEG-hydrogelen i mindst 3 dage. I løbet af denne tid fastgøres de til hydrogelen, trænger ind i den og begynder at etablere cellecellekontakter og ECM-aflejring. Før såning af hBM-MSC’erne skal opbevaringsbufferen fjernes. Da hydrogelen er placeret inde i en indre brønd inden for standardbrønden på 96-brøndens billeddannelsesplade, er det sikkert at indsætte aspirationsspidsen langs siden af brønden, indtil den berører den indre brøndring. En vakuumpumpe kan bruges til aspiration, hvis den er indstillet til den lavest mulige sugekraft. Alternativt kan en automatiseret pladevasker med dysehøjden justeret til mindst 0,8 mm over den indre brøndring bruges til at opsuge bufferen fra hydrogelpladen. Brug af automatisering til væskehåndtering kan minimere skader på hydrogeloverfladen og føre til højere reproducerbarhed af de resulterende kulturer. Små defekter på hydrogeloverfladen bliver synlige, når cellerne sætter sig på hydrogelen og vises på et lavere fokusplan i defekte hydrogelområder. Derfor tjener erhvervelse af referencebilleder på dag 0 som en god kvalitetskontrol for cellesåningshomogeniteten og hydrogeloverfladeintegriteten. Mens små hydrogeloverfladefejl ikke udelukker yderligere brug af brønden, har cellerne tendens til at klynge sig på de defekte områder og kan vokse til ikke-repræsentative mønstre eller hurtigere nå bundglasset, hvor de vokser til et monolag. Disse artefakter skal noteres, når disse brønde anvendes/evalueres. Lignende overvejelser gælder for eventuelle medieændringer, der udføres i hele assayets varighed.
Det andet trin i protokollen involverer tilsætning af GFP-HUVEC’er til den præformede hBM-MSC-monokultur (dag 0 i co-kultur). ECM deponeret af hBM-MSC giver et stort stillads til vækst af endotelceller, som i dette arbejde, selv i nærvær af hBM-MSC-konditioneret medium, kun kunne danne runde celleklynger på hydrogelerne (ikke vist). Ved såning på hBM-MSC-kulturerne integrerer og danner HUVEC’erne mikrobeholderlignende strukturer, der kan sammenlignes med dem, der observeres i co-kulturer genereret ved celleindkapsling27,28. Typisk dannes veludviklede 3D mikrovaskulære netværk inden for 4 dage efter samkultur, og dette kan overvåges i længderetningen ved brug af GFP-mærkede HUVEC’er. Disse strukturer kan opretholdes i mindst 7 dage i kultur, hvilket betyder, at der er tilstrækkelig tid til at følge ændringer i den vaskulære netværksorganisation som reaktion på behandlinger, såsom til screening af antiangiogene lægemidler. De morfologiske elementer i endotelnetværket kan kvantificeres i batch-tilstand ved at segmentere GFP-billederne ved hjælp af veletablerede værktøjer, såsom Angiogenesis Analyzer-pluginet i ImageJ33, og deres parametre kan bruges til at evaluere for eksempel lægemiddeleffektivitet og farmakodynamik.
En væsentlig fordel ved den beskrevne cellulære model til mange potentielle anvendelser er dens plasticitet. Blot at supplere kulturmediet med forskellige vækstfaktorer kan ændre co-kulturens udseende. For eksempel skaber tilstedeværelsen af BMP-2 i hele mono- og cokulturperioden en osteogen vaskulær niche, der viser øget ALP-aktivitet, ekstracellulær calciumaflejring samt ECM-samling og aflejring. Tværtimod, i nærvær af FGF-2 er de osteogene markører fraværende, og cokulturen danner færre laterale celleforeninger, men viser mere udtalt 3D-cellevækst. Det faktum, at FGF-2 undertrykker ALP-aktivitet, mens BMP-2 fremkalder stærkere ALP-aktivitet sammenlignet med ingen vækstfaktorbehandling, er i overensstemmelse med tidligere observationer27. På trods af disse store forskelle i hBM-MSC stromalkomponenten var omfanget af det mikrovaskulære netværk meget ens for de to vækstfaktorbehandlede tilstande i dette arbejde. I kontrolkulturerne blev der kun dannet nogle få korte vaskulære netværk, der måske repræsenterer en dårligt vaskulariseret knoglemarvsniche. Dette tyder på, at ved blot at ændre typen, koncentrationen og timingen af vækstfaktorerne tilsat dyrkningsmediet, kunne der produceres en række veldefinerede vaskulariserede knoglemarvsnicher, som det ville være nødvendigt for sammenlignende undersøgelser. For at sikre reproducerbare resultater er det imidlertid vigtigt at bemærke, at dyrkningsprogressionen og morfologien kan variere afhængigt af de anvendte cellers historie (f.eks. passagenummer og løsrivelsesmetode, der anvendes under rutinemæssig vedligeholdelse af kulturer), og det tilrådes at kontrollere for sådanne faktorer under analysedesignet.
Her demonstrerer vi som en første anvendelse af denne model følsomheden af de konstruerede mikrovaskulære netværk over for behandling med 10 μg/ml bevacizumab. Det er især vigtigt at bekræfte, at den anvendte algoritme nøjagtigt kan genkende endotelnetværket, da artefakter ofte genereres i billeder med dårligt udviklede netværk. Hvis dette er tilfældet, skal de parametre, der bruges til billedbehandling (før og under segmentering), finjusteres, ofte på trial-and-error-basis.
Som en anden applikation præsenterer vi en avanceret cokulturmodel dannet ved sekventiel såning af mesenkymale, endotel- og kræftceller. Denne model giver mulighed for at studere interaktionerne mellem kræftceller, stromaen og knoglemarvens vaskulatur, hvilket kan være vigtige faktorer under metastaser. Derudover kan denne model bruges til lægemiddelscreeningsapplikationer og testforbindelser med mål ud over angiogenese.
I 2D-kulturer modtager celler ikke fysiologiske mikromiljøsignaler, erhverver ikke naturligt forekommende cellemorfologier og skelner derfor forskelligt sammenlignet med celler i native 3D-miljøer35. Når de dyrkes i konstruerede 3D-hydrogeler, deponerer cellerne tidligt en iboende ECM, som giver vedhæftningssteder og aktivt kan ombygges28,36. Her, for at etablere en forenklet 3D-model til screeningsapplikationer, blev kardannende celler podet på overfladen af konstruerede hydrogeler og tilladt at etablere vaskulære netværk i fravær af perfusion. De billeddannelsesbaserede evalueringer blev udført på 2D-projektioner af endotelcellerne, der bidrager til vaskulære strukturer. Imidlertid afslørede kun konfokale billeder den mindre udtalte indvækst af de 3D vaskulære netværk i BMP-2-stimulerede prøver sammenlignet med de FGF-2-stimulerede prøver. Dette tyder på, at længden af de dannede vaskulære strukturer blev undervurderet, mens deres forbindelse blev overvurderet. Derudover er interaktioner mellem perivaskulære og endotelceller og vaskulær lumendannelse ikke undersøgt. Disse aspekter, navnlig med hensyn til narkotikabehandlingstiltag, vil kræve yderligere opmærksomhed. Endelig ville raffinerede protokoller til først at etablere omfattende 3D-vaskulære netværk og først derefter fremkalde deres osteogene differentiering være ønskelige for at generere mere fysiologiske knogle- og knoglemarvsmodeller.
Samlet set er modellen, der præsenteres her, meget alsidig og kan let skræddersys til specifikke applikationer. For eksempel kan mesenkymale og endotelceller fra forskellige kilder anvendes. Det er kendt, at fedtvævs-MSC’er og navlestrengs-MSC’er udtrykker forskellige angiogene faktorer sammenlignet med BM-MSC’er, og de kan let erstattes som en alternativ stromalkomponent37. Endotelceller isoleret fra allerede definerede knoglemarvsnicher kunne også anvendes i stedet for HUVEC’er. Man kunne også etablere co-kulturen med patientafledte, matchende knoglemarv mesenkymale og endotelceller til personlig medicin applikationer, som det for nylig er blevet foreslået for vaskulariserede muskel co-kulturer38. Derudover tillader hydrogelpladens design langsgående overvågning af kulturen med både lysfelt- og fluorescensmikroskopi, hvilket giver brugeren mulighed for at forkorte eller forlænge dyrkningstiden afhængigt af applikationen. Alternativt kan celletæthederne, der anvendes til såning, justeres i overensstemmelse hermed for at fremskynde eller forsinke dannelsen af cellenetværket, hvis der er behov for kortere eller længere observationstider end dem i denne protokol. Under alle omstændigheder er forsigtighed nødvendig for at undgå celleovervækst i arklignende strukturer, hvilket kan føre til sammentrækning af hydrogelen og eventuel cellefrigørelse.
Endelig kan en bred vifte af assays udføres ved hjælp af denne model. Ud over immunfluorescens og mikroskopi udført i levende eller faste kulturer kan 3D-kulturerne fordøjes enzymatisk, og cellerne kan hentes og udsættes for enhver form for biokemisk analyse. Her demonstrerer vi bestemmelsen af ALP-aktivitet og kvantificering af DNA-indhold i cellelysater ved hjælp af kolorimetriske / fluorometriske assays, men systemet er kompatibelt med mange andre teknikker, herunder PCR, RNAseq og proteomics. Hvis følsomheden af det ønskede assay ikke er særlig høj, kan man samle prøver fra mere end én brønd for at øge mængden af prøve, der er tilgængelig til analysen. Hvis den ønskede anvendelse kræver hurtigere gelopløsning, kan orbital omrystning af pladen påføres i kombination med mindre mængder af fordøjelsesopløsningen for at sikre hvirveldannelse i brøndene, forudsat at alle brønde på pladen vil blive brugt på denne måde (levende kulturer er følsomme over for sådan hård håndtering). Sammenfattende præsenterer vi her en protokol, der, hvis den bruges som beskrevet, garanterer genereringen af en in vitro-model , der rekapitulerer nøgleaspekterne af osteogene vaskulære nicher, men også er alsidig nok til at blive ændret til skræddersyede applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Riccardo Urbanet for teknisk assistance med væskehåndteringsenhederne og Rodi Odabasi for støtte med epifluorescensmikroskopi. Dette arbejde blev finansieret af Swiss National Science Foundation (bevillingsnumre 310030E_202429 og 205321_204318) og Ectica Technologies AG.
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
2 mL microtubes | Eppendorf | 30120094 | |
2-Amino-2-methyl-1-propanol | Sigma | A9199 | |
3DProSeed hydrogel well plate | Ectica Technologies | ECT.PS1.001.096 | |
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma | 71768 | |
Alizarin Red S | Sigma | A5533 | |
Anti-Collagen IV antibody | Abcam | ab6311 | |
Anti-Laminin 1+2 antibody | Abcam | ab7463 | |
Automated plate washer | Agilent Biotek | ELχ50 | |
Automated washer/dispenser | Agilent Biotek | MULTIFLO FX equipped with a peristaltic pump 5uL cassette | |
Bevacizumab | Evidentic | ID PS-E07-2019-00119 A009 | |
BMP-2 | Peprotech | 120-02C | |
BSA | AppliChem | A1391 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | To centrifuge 2 mL tubes at 16100 x g during ALP analysis |
Confocal laser scanning microscope | Leica | Stellaris 5 | |
Conical 50 mL centrifuge tubes | TPP | 91050 | |
DAPI | Sigma | D9542 | |
DyLight 649 Donkey anti-rabbit IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 406406 | |
DyLight 649 Goat anti-mouse IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 405312 | |
EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
Epifluorescence microscope | Leica | DMI6000B | |
FBS | Gibco | 10500-064 | |
FGF-2 | Peprotech | 100-18B | |
Fibronectin (IST-9) | Santa Cruz | sc-59826 | |
GFP-HUVECs | PELOBiotech | PB-CAP-0001GFP | |
hBM-MSCs | – | – | Isolated at University Hospital Basel; Papadimitropoulos A, Piccinini E, Brachat S, et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells from fresh bone marrow in a 3D scaffold-based system under direct perfusion. PLoS One. 2014;9(7):e102359 |
Inverted microscope | Zeiss | 200M | |
Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
MDA-MB-231 breast cancer cell line | – | Kindly obtained from J Massagué at the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | |
MEMα | Gibco | 22571-038 | |
Multimode imaging reader | Agilent Biotek | Cytation 1 | For automated imaging |
Multimode imaging reader – fluorescence and absorbance | Agilent Biotek | Cytation 5 | For measuring absorbance and fluorescence intensity duing ALP analysis |
Paraformaldehyde | Artechemis | US 040 | |
PBS | Gibco | 10010-015 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Phalloidin-rhodamine | Invitrogen | R415 | |
Picro-Sirius Red Solution | Abcam | ab246832 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | ThermoFisher Scientific | P7589 | |
Recombinant Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab260043 | |
SIGMAFAST BCIP/NBT | Sigma | B5655-25TAB | |
Sodium hydroxide | Sigma | 1064981000 | |
Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Sigma | S-0876 | |
Sodium phosphate monobasic, monohydrate | Merck | 1.06346 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Tween20 | AppliChem | A4974 | |
U2OS osteosarcoma cell line | – | Kindly obtained from J Snedeker at the Institute for Biomechanics, Zurich | |
α-trehalose dihydrate | Sigma | 90208 |