Atividade Adjuvante de Mycobacterium paratuberculosis no Aumento da Imunogenicidade de Autoantígenos Durante Encefalomielite Autoimune Experimental
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo alternativo para induzir ativamente encefalomielite autoimune experimental em camundongos C57BL/6, usando o epítopo imunogênico mielina oligodendrocyte glycoprotein (MOG)35-55 suspenso em adjuvante de Freund incompleto contendo a subespécie paratuberculosis de Mycobacterium avium morta pelo calor.
Abstract
A encefalomielite autoimune experimental (EAE) induzida pela glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG) requer imunização por um peptídeo MOG emulsionado em adjuvante de Freund completo (CFA) contendo Mycobacterium tuberculosis inativado. Os componentes antigênicos da micobactéria ativam células dendríticas para estimular as células T a produzir citocinas que promovem a resposta Th1 via receptores toll-like. Portanto, a quantidade e a espécie de micobactérias presentes durante o desafio antigênico estão diretamente relacionadas ao desenvolvimento das EAE. Este trabalho de método apresenta um protocolo alternativo para induzir EAE em camundongos C57BL/6 usando um adjuvante de Freund incompleto modificado contendo a cepa K-10 da subespécie Paratuberculosis de Mycobacterium avium morta pelo calor.
M. paratuberculosis, membro do complexo Mycobacterium avium, é o agente causador da doença de Johne em ruminantes e tem sido identificado como um fator de risco para várias doenças mediadas por células T humanas, incluindo esclerose múltipla. Em geral, camundongos imunizados com Mycobacterium paratuberculosis apresentaram início mais precoce e maior gravidade da doença do que camundongos imunizados com CFA contendo a cepa H37Ra de M. tuberculosis nas mesmas doses de 4 mg/mL. Os determinantes antigênicos da cepa K-10 de Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) foram capazes de induzir uma forte resposta celular Th1 durante a fase efetora, caracterizada por números significativamente maiores de linfócitos T (CD4+ CD27+), células dendríticas (CD11c+ I-A/I-E+) e monócitos (CD11b+ CD115+) no baço em comparação com camundongos imunizados com CFA. Além disso, a resposta proliferativa de células T ao peptídeo MOG pareceu ser maior em camundongos imunizados com M. paratuberculosis. O uso de um encefalitogênio (por exemplo, MOG35-55) emulsionado em um adjuvante contendo M. paratuberculosis na formulação pode ser um método alternativo e validado para ativar células dendríticas para priming de células T CD4+ específicas para epítopos de mielina durante a fase de indução do EAE.
Introduction
A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo comum para o estudo de doenças desmielinizantes humanas1. Existem vários modelos de EAE: imunização ativa usando diferentes peptídeos de mielina em combinação com adjuvantes potentes, imunização passiva por transferência in vitro de linfócitos CD4+ específicos da mielina e modelos transgênicos de EAE2 espontâneo. Cada um desses modelos possui características específicas que permitem o estudo de diferentes aspectos do EAE, como o início, a fase efetora ou a fase crônica. O modelo de glicoproteína de miodendrócitos (MOG) de EAE é um bom modelo para estudar os mecanismos imunomediados de neuroinflamação crônica e desmielinização, pois é caracterizado por infiltrado inflamatório mononuclear, desmielinização na substância branca periférica e recuperação reduzida após o pico da doença1.
O MOG-EAEA é induzido pela imunização de camundongos suscetíveis com o peptídeo MOG35-55 em adjuvante de Freund completo (CFA), seguido por uma injeção intraperitoneal de toxina pertussis. Isso aumenta a permeabilidade da barreira hematoencefálica e permite que as células T mielina-específicas ativadas na periferia cheguem ao sistema nervoso central (SNC), onde serão reativadas3. O CFA desempenha um papel fundamental na indução de EAE, aumentando a captação de antígenos pelas células apresentadoras de antígenos e a expressão de citocinas relacionadas a respostas humorais e mediadas por células4. Esse mecanismo deve-se principalmente à presença de Mycobacterium tuberculosis morto emulsionado em óleo, cujos componentes fornecem um forte estímulo para o sistema imune5. De fato, a indução de EAE está diretamente relacionada à quantidade de micobactéria presente durante o desafioantigênico6.
A adição de outras micobactérias mortas, como Mycobacterium butyricum, ao adjuvante de Freundincompleto7, bem como o efeito de combinações adjuvantes8, podem modular o curso clínico das EAE e, consequentemente, influenciar a reprodutibilidade dos resultados. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), agente etiológico da doença de John em ruminantes, tem sido associado a doenças inflamatórias do SNC humano9, uma vez que seus componentes antigênicos são capazes de provocar forte resposta humoral e celular em pacientes com esclerose múltiplae desordem do espectro da neuromielite óptica9. Portanto, neste protocolo, mostramos um método alternativo e reprodutível para induzir MOG-EAE substituindo M. tuberculosis em CFA por M. paratuberculosis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós demonstramos um protocolo alternativo robusto para induzir ativamente EAE grave em camundongos C57BL/6J usando o peptídeo MOG35-55 emulsionado em um adjuvante contendo M. paratuberculosis10. A indução de EAE por esse método resultou em uma doença mais grave do que a induzida pelo protocolo comum com CFA. Essa diferença pode ser devida aos diferentes componentes lipídicos na parede celular dasmicobactérias11. De fato, ao contrário de outras …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho recebeu apoio de uma bolsa da Sociedade Japonesa para a promoção da Ciência (bolsa nº. JP 23K14675).
Materials
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
References
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