En neonatal heterotopisk rottehjertetransplantasjonsmodell for studier av endotel-til-mesenkymal overgang
Summary
Dette arbeidet presenterer en dyremodell av endotel-til-mesenkymal overgangsindusert fibrose, som sett i medfødte hjertefeil som kritisk aortastenose eller hypoplastisk venstre hjertesyndrom, som muliggjør detaljert histologisk vevsevaluering, identifisering av regulatoriske signalveier og testing av behandlingsalternativer.
Abstract
Endokardial fibroelastose (EFE), definert ved subendokardial vevsakkumulering, har stor innvirkning på utviklingen av venstre ventrikkel (LV) og utelukker pasienter med medfødt kritisk aortastenose og hypoplastisk venstre hjerte-syndrom (HLHS) fra kurativ anatomisk biventrikulær kirurgisk reparasjon. Kirurgisk reseksjon er i dag eneste tilgjengelige behandlingsalternativ, men EFE kommer ofte tilbake, noen ganger med et enda mer infiltrativ vekstmønster inn i tilstøtende myokard.
For bedre å forstå de underliggende mekanismene til EFE og for å utforske terapeutiske strategier, ble det utviklet en dyremodell egnet for preklinisk testing. Dyremodellen tar hensyn til at EFE er en sykdom i det umodne hjertet og er forbundet med strømningsforstyrrelser, som støttet av kliniske observasjoner. Dermed er heterotopisk hjertetransplantasjon av nyfødte rottedonorhjerter grunnlaget for denne modellen.
Et nyfødt rottehjerte transplanteres inn i en ungdomsrottes mage og kobles til mottakerens infrarenale aorta og vena cava inferior. Mens perfusjon av koronararteriene bevarer levedyktigheten til donorhjertet, induserer strømningsstagnasjon i LV EFE-vekst i det svært umodne hjertet. Den underliggende mekanismen for EFE-dannelse er overgangen av endokardiale endotelceller til mesenkymale celler (EndMT), som er en godt beskrevet mekanisme for tidlig embryonal utvikling av ventiler og septa, men også den ledende årsaken til fibrose ved hjertesvikt. EFE-dannelse kan observeres makroskopisk i løpet av dager etter transplantasjon. Transabdominal ekkokardiografi brukes til å overvåke transplantatets levedyktighet, kontraktilitet og patensen til anastomosene. Etter eutanasi høstes EFE-vevet, og det viser de samme histopatologiske egenskapene som humant EFE-vev fra HLHS-pasienter.
Denne in vivo-modellen gjør det mulig å studere mekanismene for EFE-utvikling i hjertet og teste behandlingsalternativer for å forhindre denne patologiske vevsdannelsen og gir mulighet for en mer generalisert undersøkelse av EndMT-indusert fibrose.
Introduction
Endokardial fibroelastose (EFE), definert ved akkumulering av kollagen og elastiske fibre i subendokardialvevet, presenterer som et perleaktig eller ugjennomsiktig fortykket endokardium; EFE gjennomgår mest aktiv vekst i fosterperioden og tidlig barndom1. I en obduksjonsstudie var 70% av tilfellene med hypoplastisk venstre hjertesyndrom (HLHS) assosiert med tilstedeværelsen av EFE2.
Celler som uttrykker markører for fibroblaster er den viktigste cellepopulasjonen i EFE, men disse cellene uttrykker også samtidig endokardiale endotelmarkører, noe som er en indikasjon på opprinnelsen til disse EFE-cellene. Vår gruppe har tidligere fastslått at den underliggende mekanismen for EFE-dannelse innebærer en fenotypisk forandring av endokardiale endotelceller til fibroblaster gjennom endotel-til-mesenkymal overgang (EndMT)3. EndMT kan detekteres ved hjelp av immunhistokjemisk dobbeltfarging for endotelmarkører som klynge av differensiering (CD) 31 eller vaskulær endotelial (VE)-cadherin (CD144) og fibroblastmarkører (f.eks. alfa-glatt muskelaktin, α-SMA). Videre har vi også tidligere etablert TGF-ß-banens regulatoriske rolle i denne prosessen med aktivering av transkripsjonsfaktorene SLUG, SNAIL og TWIST3.
EndMT er en fysiologisk prosess som oppstår under embryonal hjerteutvikling og fører til dannelse av septa og ventiler fra endokardiale puter4, men det forårsaker også organfibrose ved hjertesvikt, nyrefibrose eller kreft og spiller en nøkkelrolle i vaskulær aterosklerose 5,6,7,8. EndMT ved hjertefibrose reguleres hovedsakelig gjennom TGF-β banen, som vi og andre har rapportert 3,9. Ulike stimuli har blitt beskrevet for å indusere EndMT: betennelse 10, hypoksi11, mekaniske endringer 12 og strømningsforstyrrelser, inkludert endringer i den intrakavitære blodstrømmen 13, og EndMT kan også være en konsekvens av en genetisk sykdom 14.
Denne dyremodellen ble utviklet ved hjelp av nøkkelkomponentene i hjerte-EFE-utvikling, som er umodenhet og endringer i den intrakavitære blodstrømmen, spesielt strømningsstagnasjon. Umodenhet ble oppfylt ved å bruke nyfødte rottehjerter som donorer, siden nyfødte rotter er kjent for å være utviklingsmessig umodne umiddelbart etter fødselen. Heterotopisk hjertetransplantasjon tilbød tilbud om intrakavitær flowrestriksjon15.
Fra et klinisk synspunkt tillater denne dyremodellen bedre å undersøke effekten av EndMT på den voksende venstre ventrikkelen (LV). Vekstbegrensningen som pålegges foster- og nyfødthjertet gjennom EndMT-indusert EFE-dannelse16 utelukker pasienter med venstre ventrikkels utløpskanalobstruksjoner (LVOTO) som medfødt kritisk aortastenose og hypoplastisk venstre hjerte-syndrom (HLHS) fra kurativ anatomisk biventrikulær kirurgisk reparasjon17. Denne dyremodellen forenkler studiet av cellulære mekanismer og regulering av vevsdannelse gjennom EndMT og muliggjør testing av farmakologiske behandlingsalternativer 3,18.
Transabdominal ekkokardiografi brukes til å overvåke transplantatets levedyktighet, kontraktilitet og patensen til anastomosene. Etter eutanasi kan EFE-dannelse observeres makroskopisk innen 3 dager etter transplantasjon. EFE-vev viser de samme histopatologiske egenskapene som humant EFE-vev fra pasienter med LVOTO.
Derfor kan denne dyremodellen, selv om den er utviklet for pediatrisk bruk i spekteret av HLHS, brukes når man studerer ulike sykdommer basert på den molekylære mekanismen til EndMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne dyremodellen for heterotopisk transplantasjon av et neonatalt donorrottehjerte i mottakerens mage skaper muligheten til å studere EndMT-avledet fibrose gjennom detaljert histologisk vevsevaluering, identifisere regulatoriske signalveier og teste behandlingsalternativer. Siden EndMT er den underliggende mekanismen for fibrotiske sykdommer i hjertet, har denne modellen stor verdi innen pediatrisk hjertekirurgi og utover. I denne modellen kan mange faktorer påvirke utfallet av prosedyren negativt. Dermed er riktig h…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble finansiert av Additional Ventures – Single Ventricle Research Fund (SVRF) og Single Ventricle Expansion Fund (til I.F.) og et Marietta Blau-stipend fra OeAD-GmbH fra midler fra det østerrikske føderale departementet for utdanning, vitenskap og forskning BMBWFC (til GG).
Materials
| Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000 | CWE, Inc. | 12-03100 | small animal ventilator |
| aSMA | Sigma | A2547 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Axio observer Z1 | Carl Zeiss | inverted microscope | |
| Betadine Solution | Avrio Health L.P. | 367618150092 | |
| CD31 | Invitrogen | MA1-80069 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DemeLON Nylon black 10-0 | DemeTECH | NL76100065F0P | 10-0 Nylon suture |
| ETFE IV Catheter, 18G x 2 | TERUMO SURFLO | SR-OX1851CA | intubation cannula |
| Micro Clip 8mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6471 | microvascular clamps |
| Nylon black monofilament 11-0 | SURGICAL SPECIALTIES CORP | AA0130 | 11-0 Nylon |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for frozen tissue specimen |
| p-SMAD2/3 | Invitrogen | PA5-110155 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC. | 000A3467 | oblique shelf for intubation |
| Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0 | Braintree Scientific | NC9201231 | Silk suture |
| Slug/Snail | Abcam | ab180714 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18" | Ethicon | J493G | 5-0 Vicryl |
| Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18" | Ethicon | J492G | 6-0 Vicryl |
| VE-Cadherin | Abcam | ab231227 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Zeiss OPMI 6-SFR | Zeiss | Surgical microscope | |
| Zen, Blue Edition, 3.6 | Zen | inverted microscope software |
References
- Lurie, P. R. Changing concepts of endocardial fibroelastosis. Cardiology in the Young. 20 (2), 115-123 (2010).
- Crucean, A., et al. Re-evaluation of hypoplastic left heart syndrome from a developmental and morphological perspective. Orphanet Journal of Rare Diseases. 12 (1), 138 (2017).
- Xu, X., et al. Endocardial fibroelastosis is caused by aberrant endothelial to mesenchymal transition. Circulation Research. 116 (5), 857-866 (2015).
- Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
- Illigens, B. M., et al. Vascular endothelial growth factor prevents endothelial-to-mesenchymal transition in hypertrophy. Annals of Thoracic Surgery. 104 (3), 932-939 (2017).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (12), 2282-2287 (2008).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Recherche en cancérologie. 67 (21), 10123-10128 (2007).
- Souilhol, C., Harmsen, M. C., Evans, P. C., Krenning, G. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 114 (4), 565-577 (2018).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Rieder, F., et al. Inflammation-induced endothelial-to-mesenchymal transition: A novel mechanism of intestinal fibrosis. American Journal of Pathology. 179 (5), 2660-2673 (2011).
- Johnson, F. R. Anoxia as a cause of endocardial fibroelastosis in infancy. AMA Archives of Pathology. 54 (3), 237-247 (1952).
- Shimada, S., et al. Distention of the immature left ventricle triggers development of endocardial fibroelastosis: An animal model of endocardial fibroelastosis introducing morphopathological features of evolving fetal hypoplastic left heart syndrome. Biomedical Research. 2015, 462-469 (2015).
- Weixler, V., et al. Flow disturbances and the development of endocardial fibroelastosis. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (2), 637-646 (2020).
- Purevjav, E., et al. Nebulette mutations are associated with dilated cardiomyopathy and endocardial fibroelastosis. Journal of the American College of Cardiology. 56 (18), 1493-1502 (2010).
- Friehs, I., et al. An animal model of endocardial fibroelastosis. Journal of Surgical Research. 182 (1), 94-100 (2013).
- Emani, S. M., et al. Staged left ventricular recruitment after single-ventricle palliation in patients with borderline left heart hypoplasia. Journal of the American College of Cardiology. 60 (19), 1966-1974 (2012).
- Hickey, E. J., et al. Critical left ventricular outflow tract obstruction: The disproportionate impact of biventricular repair in borderline cases. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 134 (6), 1429-1436 (2007).
- Oh, N. A., et al. Abnormal flow conditions promote endocardial fibroelastosis via endothelial-to-mesenchymal transition, which is responsive to losartan treatment. JACC: Basic to Translational Science. 6 (12), 984-999 (2021).
- Blanchard, J. M., Pollak, R. Techniques for perfusion and storage of heterotopic heart transplants in mice. Microsurgery. 6 (3), 169-174 (1985).
- Kokudo, T., et al. Snail is required for TGFbeta-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells. Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Clark, E. S., et al. A mouse model of endocardial fibroelastosis. Cardiovascular Pathology. 24 (6), 388-394 (2015).
- Kovacic, J. C., et al. Endothelial to mesenchymal transition in cardiovascular disease: JACC state-of-the-art review. Journal of the American College of Cardiology. 73 (2), 190-209 (2019).
- Derynck, R., Zhang, Y. E. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling. Nature. 425 (6958), 577-584 (2003).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on design, execution, and reporting of animal atherosclerosis studies: A scientific statement from the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).
