Skjelettmuskulatur består av flere celletyper, inkludert bosatt stamceller, hver med et spesielt bidrag til muskelhomeostase og regenerering. Her beskrives 2D-kulturen av muskelstamceller og muskelcellenisjen i en ex vivo-setting som bevarer mange av de fysiologiske, in vivo og miljømessige egenskapene.
Skjelettmuskulatur er det største vevet i kroppen og utfører flere funksjoner, fra bevegelse til kroppstemperaturkontroll. Dens funksjonalitet og utvinning fra skader avhenger av en rekke celletyper og på molekylære signaler mellom kjernemuskelcellene (myofibre, muskelstamceller) og deres nisje. De fleste eksperimentelle innstillinger bevarer ikke dette komplekse fysiologiske mikromiljøet, og de tillater heller ikke ex vivo-studien av muskelstamceller i hvile, en celletilstand som er avgjørende for dem. Her er en protokoll skissert for ex vivo-kulturen av muskelstamceller med cellulære komponenter i deres nisje. Gjennom mekanisk og enzymatisk nedbrytning av muskler oppnås en blanding av celletyper, som settes i 2D-kultur. Immunofarging viser at innen 1 uke er flere nisjeceller tilstede i kultur sammen med myofibre og, viktigere, Pax7-positive celler som viser egenskapene til hvilende muskelstamceller. Disse unike egenskapene gjør denne protokollen til et kraftig verktøy for celleforsterkning og generering av hvilelignende stamceller som kan brukes til å løse grunnleggende og translasjonsspørsmål.
Bevegelse, pust, metabolisme, kroppsstilling og vedlikehold av kroppstemperatur er alle avhengige av skjelettmuskulatur, og funksjonsfeil i skjelettmuskulaturen kan dermed forårsake svekkende patologier (dvs. myopatier, muskeldystrofier, etc.) 1. Gitt sine essensielle funksjoner og overflod, har skjelettmuskulatur trukket oppmerksomheten til forskningslaboratorier over hele verden som streber etter å forstå de viktigste aspektene som støtter normal muskelfunksjon og kan tjene som terapeutiske mål. I tillegg er skjelettmuskulatur en mye brukt modell for å studere regenerering og stamcellefunksjon, da sunn muskel kan fullstendig reparere seg selv etter fullstendig skade og degenerasjon, hovedsakelig på grunn av de bosatte stamceller2; Disse kalles også satellittceller og er lokalisert under basal lamina i periferien av muskelfibrene3.
Kjernecellene i voksen skjelettmuskulatur er myofibrene (lange syncytiale multinukleære celler) og satellittcellene (stamceller med myogent potensial som hviler til en skade aktiverer dem). De sistnevnte cellene er de sentrale cellene i muskelregenerering, og denne prosessen kan ikke forekomme i deres fravær 4,5,6,7. I deres umiddelbare mikromiljø er det flere celletyper og molekylære faktorer som signaliserer til dem. Denne nisjen etableres gradvis gjennom utviklingen og frem til voksen alder8. Voksen muskel inneholder flere celletyper (endotelceller, pericytter, makrofager, fibro-adipogene progenitorer-FAPs, regulatoriske T-celler, etc.) 9,10 og ekstracellulære matrikskomponenter (lamininer, kollagen, fibronektin, fibrilliner, periostin, etc.) 11 som samhandler med hverandre og med satellittcellene i sammenheng med helse, sykdom og regenerering.
Å bevare denne komplekse nisjen i eksperimentelle omgivelser er grunnleggende, men utfordrende. Like vanskelig er det å opprettholde eller gå tilbake til hvile, en celletilstand som er kritisk for satellittceller9. Flere metoder har blitt introdusert for delvis å takle disse utfordringene, hver med sine fordeler og ulemper (detaljert i diskusjonsdelen). Her presenteres en metode som delvis kan overvinne disse to barrierene. Muskler blir først høstet og deretter brutt ned mekanisk og enzymatisk før den heterogene celleblandingen settes i kultur. I løpet av kulturen oppdages mange celletyper av nisje, og satellittceller som har returnert til stillhet, observeres. Som et siste trinn i protokollen presenteres immunfluorescenstrinnene som muliggjør deteksjon av hver celletype ved bruk av universelt aksepterte markører.
Voksen skjelettmuskelfunksjon støttes av et fint orkestrert sett med cellulære interaksjoner og molekylære signaler. Her presenteres en metode som gjør det mulig å studere disse parametrene i en ex vivo-setting som ligner det fysiologiske mikromiljøet.
Flere grupper har rapportert in vitro-metoder for dyrkning av myogene celler. Disse metodene hadde som mål å isolere satellittceller for å studere deres myogene stamegenskaper. To hovedtilnærminger brukes til å isole…
The authors have nothing to disclose.
Til figur 2 ble det brukt maler fra Servier Medical Art (https://smart.servier.com/). FR-laboratoriet støttes av Association Française contre les Myopathies – AFM via TRANSLAMUSCLE (tilskudd 19507 og 22946), Fondation pour la Recherche Médicale – FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), Agence Nationale pour la Recherche – ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73) og La Ligue Contre le Cancer (IP / SC-17130). Ovennevnte finansiører hadde ingen rolle i utformingen, innsamlingen, analysen, tolkningen eller rapporteringen av denne studien eller skrivingen av dette manuskriptet.
anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |