Skelettmuskulaturen består av flera celltyper, inklusive stamceller, var och en med ett särskilt bidrag till muskelhomeostas och regenerering. Här beskrivs 2D-odlingen av muskelstamceller och muskelcellnischen i en ex vivo-miljö som bevarar många av de fysiologiska, in vivo– och miljöegenskaperna.
Skelettmuskulaturen är den största vävnaden i kroppen och utför flera funktioner, från rörelse till kroppstemperaturkontroll. Dess funktionalitet och återhämtning från skador beror på en mängd olika celltyper och på molekylära signaler mellan kärnmuskelcellerna (myofibrer, muskelstamceller) och deras nisch. De flesta experimentella miljöer bevarar inte denna komplexa fysiologiska mikromiljö, och de tillåter inte heller ex vivo-studier av muskelstamceller i vila, ett celltillstånd som är avgörande för dem. Här beskrivs ett protokoll för ex vivo-odling av muskelstamceller med cellulära komponenter i deras nisch. Genom mekanisk och enzymatisk nedbrytning av muskler erhålls en blandning av celltyper, som sätts i 2D-odling. Immunfärgning visar att inom 1 vecka finns flera nischceller i odling tillsammans med myofibrer och, viktigare, Pax7-positiva celler som uppvisar egenskaperna hos vilande muskelstamceller. Dessa unika egenskaper gör detta protokoll till ett kraftfullt verktyg för cellamplifiering och generering av vilande stamceller som kan användas för att ta itu med grundläggande och translationella frågor.
Rörelse, andning, ämnesomsättning, kroppshållning och upprätthållande av kroppstemperatur beror alla på skelettmuskulaturen, och funktionsstörningar i skelettmuskulaturen kan därför orsaka försvagande patologier (dvs. myopatier, muskeldystrofier, etc.) 1. Med tanke på dess väsentliga funktioner och överflöd har skelettmuskulaturen uppmärksammats av forskningslaboratorier över hela världen som strävar efter att förstå de viktigaste aspekterna som stöder normal muskelfunktion och kan fungera som terapeutiska mål. Dessutom är skelettmuskulatur en allmänt använd modell för att studera regenerering och stamcellsfunktion, eftersom friska muskler kan reparera sig själva helt efter fullständig skada och degeneration, främst på grund av dess inneboende stamceller2; Dessa kallas också satellitceller och är lokaliserade under den basala laminan i periferin av muskelfibrerna3.
Kärncellerna i vuxen skelettmuskulatur är myofibrerna (långa syncytiala multinukleära celler) och satellitcellerna (stamceller med myogen potential som är vilande tills en skada aktiverar dem). De senare cellerna är de centrala cellerna för muskelregenerering, och denna process kan inte ske i deras frånvaro 4,5,6,7. I deras omedelbara mikromiljö finns det flera celltyper och molekylära faktorer som signalerar till dem. Denna nisch etableras gradvis under hela utvecklingen och fram till vuxen ålder8. Vuxna muskler innehåller flera celltyper (endotelceller, pericyter, makrofager, fibro-adipogenic progenitors-FAPs, regulatoriska T-celler, etc.) 9,10 och extracellulära matriskomponenter (lamininer, kollagener, fibronektin, fibrillliner, periostin, etc.) 11 som interagerar med varandra och med satellitcellerna i samband med hälsa, sjukdom och regenerering.
Att bevara denna komplexa nisch i experimentella miljöer är grundläggande men utmanande. Lika svårt är det att bibehålla eller återgå till vila, ett celltillstånd som är kritiskt för satellitceller9. Flera metoder har introducerats för att delvis ta itu med dessa utmaningar, var och en med sina för- och nackdelar (beskrivs i diskussionsavsnittet). Här presenteras en metod som delvis kan överbrygga dessa två hinder. Musklerna skördas först och bryts sedan ner mekaniskt och enzymatiskt innan den heterogena cellblandningen odlas. Under odlingens gång detekteras många celltyper i nischen, och satellitceller som har återgått till vila observeras. Som ett sista steg i protokollet presenteras de immunofluorescenssteg som gör det möjligt att detektera varje celltyp genom användning av universellt accepterade markörer.
Funktionen hos vuxna skelettmuskler stöds av en fint orkestrerad uppsättning cellulära interaktioner och molekylära signaler. Här presenteras en metod som gör det möjligt att studera dessa parametrar i en ex vivo-miljö som liknar den fysiologiska mikromiljön.
Flera grupper har rapporterat in vitro-metoder för att odla myogena celler. Dessa metoder syftade till att isolera satellitceller för att studera deras myogena stamegenskaper. Två huvudsakliga metoder använd…
The authors have nothing to disclose.
För figur 2 användes mallar från Servier Medical Art (https://smart.servier.com/). FR-laboratoriet stöds av Association Française contre les Myopathies – AFM via TRANSLAMUSCLE (bidrag 19507 och 22946), Fondation pour la Recherche Médicale – FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), Agence Nationale pour la Recherche – ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73) och La Ligue Contre le Cancer (IP/SC-17130). Ovanstående finansiärer hade ingen roll i utformningen, insamlingen, analysen, tolkningen eller rapporteringen av denna studie eller skrivandet av detta manuskript.
anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |