Skeletmuskulatur omfatter flere celletyper, herunder residente stamceller, hver med et særligt bidrag til muskelhomeostase og regenerering. Her beskrives 2D-kulturen af muskelstamceller og muskelcellenichen i en ex vivo-indstilling, der bevarer mange af de fysiologiske, in vivo og miljømæssige egenskaber.
Skeletmuskulatur er kroppens største væv og udfører flere funktioner, fra bevægelse til kropstemperaturkontrol. Dens funktionalitet og genopretning fra skader afhænger af en lang række celletyper og af molekylære signaler mellem kernemuskelcellerne (myofibre, muskelstamceller) og deres niche. De fleste eksperimentelle indstillinger bevarer ikke dette komplekse fysiologiske mikromiljø, og de tillader heller ikke ex vivo-undersøgelse af muskelstamceller i hvile, en celletilstand, der er afgørende for dem. Her skitseres en protokol for ex vivo-kulturen af muskelstamceller med cellulære komponenter i deres niche. Gennem mekanisk og enzymatisk nedbrydning af muskler opnås en blanding af celletyper, som sættes i 2D-kultur. Immunfarvning viser, at inden for 1 uge er flere nicheceller til stede i kultur sammen med myofibre og vigtigere Pax7-positive celler, der viser egenskaberne ved hvilende muskelstamceller. Disse unikke egenskaber gør denne protokol til et kraftfuldt værktøj til celleforstærkning og generering af hvilende-lignende stamceller, der kan bruges til at løse grundlæggende og translationelle spørgsmål.
Bevægelse, vejrtrækning, stofskifte, kropsholdning og vedligeholdelse af kropstemperatur afhænger alle af skeletmuskulatur, og funktionsfejl i skeletmuskulaturen kan således forårsage svækkende patologier (dvs. myopatier, muskeldystrofier osv.) 1. I betragtning af dets væsentlige funktioner og overflod har skeletmuskulatur henledt opmærksomheden fra forskningslaboratorier over hele verden, der stræber efter at forstå de vigtigste aspekter, der understøtter normal muskelfunktion og kan tjene som terapeutiske mål. Derudover er skeletmuskulatur en meget anvendt model til at studere regenerering og stamcellefunktion, da sund muskel fuldt ud kan reparere sig selv efter fuldstændig skade og degeneration, hovedsagelig på grund af dens hjemmehørende stamceller2; Disse kaldes også satellitceller og er lokaliseret under basal lamina i periferien af muskelfibrene3.
Kernecellerne i voksen skeletmuskulatur er myofibrene (lange syncytiale multinukleære celler) og satellitcellerne (stamceller med myogent potentiale, der er hvilende, indtil en skade aktiverer dem). Sidstnævnte celler er de centrale celler i muskelregenerering, og denne proces kan ikke forekomme i deres fravær 4,5,6,7. I deres umiddelbare mikromiljø er der flere celletyper og molekylære faktorer, der signalerer til dem. Denne niche etableres gradvist gennem udvikling og indtil voksenalderen8. Voksen muskel indeholder flere celletyper (endotelceller, pericytter, makrofager, fibro-adipogene stamceller-FAP’er, regulatoriske T-celler osv.) 9,10 og ekstracellulære matrixkomponenter (lamininer, kollagener, fibronectin, fibrilliner, periostin osv.) 11, der interagerer med hinanden og med satellitcellerne i forbindelse med sundhed, sygdom og regenerering.
Bevarelse af denne komplekse niche i eksperimentelle indstillinger er grundlæggende, men udfordrende. Lige så vanskeligt er det at opretholde eller vende tilbage til hvile, en celletilstand, der er kritisk for satellitceller9. Der er indført flere metoder til delvist at tackle disse udfordringer, hver med sine fordele og ulemper (detaljeret i diskussionsafsnittet). Her præsenteres en metode, der delvist kan overvinde disse to barrierer. Muskler høstes først og nedbrydes derefter mekanisk og enzymatisk, før den heterogene celleblanding sættes i kultur. I løbet af kulturen detekteres mange celletyper af nichen, og satellitceller, der er vendt tilbage til hvile, observeres. Som et sidste trin i protokollen præsenteres immunofluorescenstrinnene, der muliggør påvisning af hver celletype ved brug af universelt accepterede markører.
Voksen skeletmuskelfunktion understøttes af et fint orkestreret sæt cellulære interaktioner og molekylære signaler. Her præsenteres en metode, der giver mulighed for undersøgelse af disse parametre i en ex vivo-indstilling , der ligner det fysiologiske mikromiljø.
Flere grupper har rapporteret in vitro metoder til dyrkning af myogene celler. Disse metoder havde til formål at isolere satellitceller for at studere deres myogene stamfaderegenskaber. To hovedmetoder anven…
The authors have nothing to disclose.
Til figur 2 blev der brugt skabeloner fra Servier Medical Art (https://smart.servier.com/). FR-laboratoriet støttes af Association Française contre les Myopathies – AFM via TRANSLAMUSCLE (tilskud 19507 og 22946), Fondation pour la Recherche Médicale – FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), Agence Nationale pour la Recherche – ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73) og La Ligue Contre le Cancer (IP/SC-17130). Ovennævnte bidragydere havde ingen rolle i udformningen, indsamlingen, analysen, fortolkningen eller rapporteringen af denne undersøgelse eller skrivningen af dette manuskript.
anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |