Microarray polymer profiling (MAPP) er en high-throughput teknik til sammensætningsanalyse af glycaner i biologiske prøver.
Microarray polymer profiling (MAPP) er en robust og reproducerbar tilgang til systematisk bestemmelse af sammensætningen og den relative overflod af glycaner og glycokonjugater inden for en række biologiske prøver, herunder plante- og algevæv, fødevarematerialer og prøver fra mennesker, dyr og mikrobielle. Microarray-teknologi understøtter effektiviteten af denne metode ved at tilvejebringe en miniaturiseret screeningsplatform med høj kapacitet, der gør det muligt at karakterisere tusindvis af interaktioner mellem glycaner og meget specifikke glycanstyrede molekylære sonder samtidigt ved kun at bruge små mængder analysander. Bestanddele glycaner fraktioneres kemisk og enzymatisk, før de ekstraheres sekventielt fra prøven og direkte immobiliseres på nitrocellulosemembraner. Glykansammensætningen bestemmes ved fastgørelse af specifikke glycangenkendende molekylære sonder til de afpressede og trykte molekyler. MAPP supplerer konventionelle glykananalyseteknikker, såsom monosaccharid- og koblingsanalyse og massespektrometri. Imidlertid giver glykangenkendende molekylære sonder indsigt i de strukturelle konfigurationer af glycaner, som kan hjælpe med at belyse biologiske interaktioner og funktionelle roller.
Glykaner er allestedsnærværende på alle områder af livet og udviser uovertruffen mangfoldighed i struktur og funktion sammenlignet med andre makromolekyler1. På grund af deres kompleksitet, variabilitet i biosyntese og glycosidbindinger og manglen på passende metoder til dissekering af glykanstrukturer er vores forståelse af denne mangfoldighed i strukturer og funktioner imidlertid relativt begrænset2.
Mange glykananalyseteknikker er destruktive og nødvendiggør nedbrydning af glycaner i deres bestanddele monosaccharider, hvilket kan skjule relevante tredimensionelle og biologiske sammenhænge3. Omvendt genkender og binder monoklonale antistoffer (mAbs), kulhydratbindingsmoduler (CBM’er), lektiner, virale agglutininer og mikrobielle adhæsiner, samlet kendt som glycangenkendende molekylære sonder (GRMP’er)4, til specifikke epitoper og kan bruges som værktøjer til at detektere og skelne mellem glycaner inden for komplekse multiglycanmatricer 5,6.
Her præsenterer vi microarray polymer profiling (MAPP), en hurtig, alsidig og ikke-destruktiv metode til glykananalyse, der kan anvendes til et bredt spektrum af biologiske prøver. Metoden sigter mod at tilvejebringe en robust og høj kapacitet til analyse af glycaner fra forskellige biologiske og industrielle / kommercielle systemer. MAPP forener genkendelsesspecificiteten af glykanrettede molekylære sonder med reproducerbar, højtydende microarray-screeningsteknologi for at gøre det muligt at profilere tusindvis af molekylære interaktioner parallelt. Resultatet af denne tilgang er diagnostisk indsigt i sammensætningen og den relative overflod af glycaner i en prøve eller væv af interesse.
MAPP kan anvendes som en uafhængig, enkeltstående metode eller sammen med andre biokemiske teknikker, såsom immunofluorescensmikroskopi 7,8,9 og monosaccharid- eller koblingsanalyse10,11. Teknikken kan også bruges til at kortlægge epitopspecificiteter af nye GRMP’er ved hjælp af arrays trykt med rene og strukturelt veldefinerede oligosaccharidstandarder12. En stor fordel ved MAPP i forhold til andre metoder, såsom enzymbundet immunosorbentassay (ELISA), er dens kompatibilitet med små prøvevolumener 13,14. Desuden tilbyder MAPP signifikant højere gennemstrømningsanalyse15 og giver en effektiv form for prøvekonservering, da trykte prøver er tørre og stabile, når de immobiliseres på nitrocellulose16.
Bindingen af GRMP’er er generelt afhængig af tilstedeværelsen af et antal sammenhængende sukkerrester, der tilsammen danner et bindingssted (epitop), der er unikt for en bestemt polysaccharidklasse (xylan, mannan, xyloglucan osv.) 17. I modsætning hertil kan de enkelte sukkerrester (xylose, mannose, glucose), der kvantificeres ved hjælp af de fleste biokemiske teknikker, f.eks. monosaccharidsammensætning eller methyleringsanalyse, være bestanddele af flere polysaccharidklasser og dermed vanskelige at tildele18.
MAPP er udviklet som reaktion på et teknologisk hul, nemlig evnen til hurtigt at analysere flere glykaner fra en række forskellige kilder ved hjælp af små mængder materiale. MAPP udnytter det omfattende repertoire af GRMP’er, der er blevet udviklet og karakteriseret i løbet af de sidste tre årtier 12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Udviklingen af MAPP har været en iterativ proces, hvor teknikken løbende er blevet forfinet og optimeret. Der er nu en betydelig mængde litteratur, der beskriver anvendelsen af MAPP på forskellige naturlige og industrielle systemer, hvor glycaner spiller centrale roller 5,6,9,10,21,33,34,35,36,37,38,39. Her beskriver vi den aktuelle state of the art for MAPP.
MAPP-teknikken beskrevet her er nu en veletableret metode til glykananalyse. De grundlæggende principper blev først beskrevet i 200711, men teknikken har gennemgået løbende udvikling for at udnytte de nyeste innovationer inden for microarray-teknologi, molekylær sondeudvikling og fremskridt i vores forståelse af glykanbiokemi. Generelt er glycaner, især polysaccharider, mere udfordrende at analysere end proteiner og nukleotider på grund af deres strukturelle kompleksitet og heterogenitet45, samt det faktum, at de ikke let kan sekventeres eller syntetiseres1. I mange tilfælde kan ingen enkelt teknik dechiffrere glykankompleksitet endeligt; således bruges MAPP ofte med andre metoder. Dette er en af grundene til, at AIR-forberedelse normalt vælges som udgangspunkt for MAPP, da AIR er kompatibel med de fleste andre glykananalysemetoder34, hvilket letter den efterfølgende sammenligning af datasæt.
På grund af homogenisering af prøven før AIR-forberedelse går nogle rumlige oplysninger altid tabt. Da polysaccharider imidlertid frigives sekventielt fra prøver, giver tilstedeværelsen af epitoper i de opnåede fraktioner information om prøvens molekylære arkitektur og sammensætning17. Valg af et passende ekstraktionsregime er således afgørende for metodens succes. Flere parametre bestemmer ekstraktionsmetodens egnethed: cellulær struktur, tid, temperatur, pH, tryk, opløsningsmidlets ionstyrke og finhed af den faste partikelprøve49. Det anbefales, at en række stadig mere aggressive opløsningsmidler anvendes for at maksimere sandsynligheden for vellykket ekstraktion af glycanbestanddele og opbygning af et repræsentativt sammensætningsbillede af prøven. For de fleste prøver er CDTA, NaOH og cellulase tilstrækkelige til at fjerne planteafledt opbevaring og cellevægspolysaccharider 33,50,51,52. For nogle vævsprøver har et hybridekstraktionsregime, der også omfatterCaCl2, HCI ogNa2CO3, vist sig at være vellykket53, mens marine mikroalgeprøver kan kræve tilsætning af ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA)10.
Mikroarrays bør omfatte en række rene, definerede glykanstandarder, der skal anvendes som positive kontroller5. Inkluderede standarder bør ændres i overensstemmelse med stikprøvens art. Når de er udskrevet, skal der vælges passende GRMP’er. Genereringen af hybridoma mAbs til polysaccharidstrukturer er udfordrende54; Glykanbindende antistoffer er vanskelige at hæve og kan have lav affinitet55. Heldigvis kan gensekvensinformation for CBM’er opnås relativt let for rekombinant ekspression4 og engineering af deres bindingsspecificiteter56,57. Selv om der er udviklet et imponerende katalog over GRMP’er, hvor de fleste nu er tilgængelige fra kommercielle kilder, er der i forhold til mangfoldigheden af glykanstrukturer, der findes i naturen, kun blevet produceret og karakteriseret med succes58. Dette kan begrænse evnen til at opdage og skelne mellem visse strukturer. Det tilrådes at udføre et indledende sondeforsøg ved hjælp af en eller to sonder, der er repræsentative for hver større glykanstruktur, der forventes at være til stede, for hvilken bindingsspecificiteten er velkarakteriseret. I efterfølgende sondeeksperimenter kan sondelisten udvides til at dække et bredere udvalg af glycaner og dykke dybere ned i fine strukturer.
Selvom det er dagligdags, er det grundlæggende for sonderingprocedurens succes at sikre, at mikroarrays vaskes grundigt efter hvert inkubationstrin. Den ineffektive fjernelse af ikke-specifikt bundne sonder vil sandsynligvis skjule resultatet ved at forårsage et højt baggrundssignal efter farveudvikling. I dette tilfælde er det nødvendigt at gentage sonderingsproceduren, begyndende med et nyt mikroarray. Desuden bør arrays røres sparsomt og kun ved at holde kanterne med tang; Nitrocellulosemembranen er sprød og let beskadiget. Farveudviklingsløsningen samler sig i revner og folder, hvilket forårsager overmætning, hvilket forhindrer arrayanalyse.
MAPP er hurtig, tilpasningsdygtig og praktisk. Denne metode er kompatibel med dyre-, mikrobielle eller planteglycaner afledt af ethvert biologisk eller industrielt system, så længe de kan ekstraheres og immobiliseres på nitrocellulose, og for hvilke man har passende molekylære sonder. De genererede data giver detaljeret, semikvantitativ, sammensætningsmæssig indsigt, som ikke let kan opnås via andre glykananalysemetoder.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende ArrayJet for deres ekspertrådgivning vedrørende microarray robotik. SS og JS vil gerne anerkende støtten fra Fundamental Fund 2022 (FF65/004), Chiang Mai University.
1,3:1,4-β-D-Glucan, Lichenan (icelandic moss) | Megazyme | P-LICHN | |
1,4-β-D-Mannan | Megazyme | P-MANCB | |
384-well microtiter plate | Greiner Bio-One | M1686 | |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Melford | B74100-1.0 | |
Acetone | Sigma | 270725 | |
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-055-003 | |
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 112-055-003 | |
Alkaline Phosphatase AffiniPure Rabbit Anti-His Tag | Jackson ImmunoResearch | 300-055-240 | |
Arabinoxylan (wheat) | Megazyme | P-WAXYL | |
Array-Pro Analyzer Software | Media Cybernetics | Version 6.3 | |
Bacillus sp. Cellulase 5A (BCel5A) | NZYTech | CZ0564 | |
BAM antibodies | SeaProbes | Various | |
Black drawing ink (indian ink) | Winsor & Newton | GWD030 | |
Carbohydrate binding modules | NZYTech | Various | |
CCRC antibodies | CarboSource | Various | |
CDTA | Sigma | 319945 | |
Chloroform | Sigma | PHR1552 | |
Ethanol | Sigma | 1.11727 | |
Galactan (potato) | Megazyme | P-GALPOT | |
Galactomannan (carob) | Megazyme | P-GALML | |
Glycerol solution | Sigma | 49781-5L | |
Gum tragacanth (legumes) | Sigma-Aldrich | G1128 | |
INCh antibodies | INRA | Various | |
LM and JIM antibodies | PlantProbes | Various | |
Marathon Argus Microarray Printer | ArrayJet | ||
Methanol | Sigma | 34860 | |
Monoclonal antibodies | Biosupplies Australia | Various | |
NaBH4 | Sigma | 452882 | |
NaOH | Sigma | S5881 | |
Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Melford | N66000-1.0 | |
Nitrocellulose membrane | Thermo Fisher Scientific | 88018 | |
Pectin (degree of methyl esterification 46%) | Danisco | NA | |
ProClin 200 | Sigma | 48171-U | |
Rhamnogalacturonan (soybean pectic fibre) | Megazyme | P-RHAGN | |
Rotating mixer | Fisher Scientific | 88-861-050 | |
Rotating/rocking Shaker | Cole-Parmer | ||
Skimmed milk powder | Marvel | ||
Spin filter | Costar Spin-X | 8160 | |
Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
Tris | Sigma | 93362 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | |
Xylan (beechwood) | Megazyme | P-XYLNBE | |
Xyloglucan (tamarind) | Megazyme | P-XYGLN | |
β-Glucan (oat) | Megazyme | P-BGOM |