La détermination des unités formant des colonies (UFC) est la technique de référence pour quantifier les bactéries, y compris Mycobacterium tuberculosis qui peut prendre des semaines pour former des colonies visibles. Nous décrivons ici une micro-UFC pour la détermination de l’UFC avec une efficacité accrue en termes de temps, un espace de laboratoire et un coût de réactif réduits, et une évolutivité pour les expériences à moyen et haut débit.
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Article de méthode
Dosage d’unités formant des microcolonies pour l’évaluation de l’efficacité des vaccins contre la tuberculose
Dans cet article
Résumé
Résumé
La tuberculose, première cause de décès par agent infectieux dans le monde, a tué 1,6 million de personnes en 2022, n’étant dépassée que par la COVID-19 pendant la pandémie de 2019-2021. La maladie est causée par la bactérie Mycobacterium tuberculosis (M.tb). La souche de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), le seul vaccin contre la tuberculose, est le plus ancien vaccin homologué au monde, toujours utilisé. À l’heure actuelle, 12 vaccins font l’objet d’essais cliniques et des dizaines de vaccins sont en cours de développement préclinique. La méthode de choix utilisée pour évaluer l’efficacité des vaccins antituberculeux dans les études précliniques est le dénombrement des colonies bactériennes par le test des unités formant colonies (UFC). Ce test fastidieux prend de 4 à 6 semaines à conclure, nécessite un espace de laboratoire et d’incubateur important, a des coûts de réactifs élevés et est sujet à la contamination. Nous décrivons ici une méthode optimisée pour le dénombrement des colonies, la micro-UFC (mCFU), qui offre une solution simple et rapide pour analyser les résultats d’efficacité du vaccin contre la tubercule anti-M.tb . Le test mCFU nécessite dix fois moins de réactifs, réduit la période d’incubation par trois, prenant 1 à 2 semaines pour conclure, réduit l’espace de laboratoire et le coût des réactifs, et minimise les risques pour la santé et la sécurité associés au travail avec un grand nombre de M.tb. De plus, pour évaluer l’efficacité d’un vaccin antituberculeux, des échantillons peuvent être prélevés à partir de diverses sources, y compris des tissus d’animaux vaccinés infectés par des mycobactéries. Nous décrivons également une méthode optimisée pour produire une culture mycobactérienne unicellulaire, uniforme et de haute qualité pour les études d’infection. Enfin, nous proposons que ces méthodes soient universellement adoptées pour les études précliniques de détermination de l’efficacité des vaccins, ce qui, en fin de compte, conduirait à réduire le temps de développement des vaccins contre la tuberculose.
Introduction
La tuberculose est la principale cause de décès dans le monde causée par un seul agent infectieux, la bactérie Mycobacterium tuberculosis (M.tb), qui tue plus de personnes que tout autre agent pathogène. En 2021, la tuberculose a été responsable de 1,6 million de décès et a été dépassée par la COVID-19 pendant la pandémie de 2019-20211. De plus, selon le rapport mondial sur la tuberculose de 2022 de l’Organisation mondiale de la santé, la pandémie de COVID-19 a été responsable d’une augmentation des nouveaux cas de tuberculose. L’OMS signale également une forte baisse du nombre de personnes diagnostiquées avec la tuberculose a....
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Protocole
REMARQUE : Le protocole décrit ici est pour le BCG mais peut être appliqué à n’importe quelle mycobactérie. Le BCG peut être utilisé comme bactérie de substitution pour les expériences sur la tuberculose lorsque les installations BSL3 ne sont pas disponibles22. Les procédures suivantes utilisant le BCG doivent être effectuées dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL2) et suivre les directives de biosécurité appropriées et les bonnes pratiques de laboratoire pour la manipulation des micro-organismes du groupe de danger 2.
1. Préparation des milieux de culture
- Préparez le bouillon ....
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Résultats
Le test mCFU décrit ici augmente la quantité d’informations pouvant être récupérées à partir d’une seule boîte de Pétri à au moins 96 fois. La figure 5 illustre une comparaison de deux méthodes d’administration de médicaments pour l’utilisation réorientée du saquinavir (SQV)31,32 comme médicament dirigé contre l’hôte pour traiter la tuberculose. Dans ce test, quatre souches différentes de Mycobacterium tuberculosis ont été u.......
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Discussion
La tuberculose est un problème de santé publique important qui prend de plus en plus d’importance, en particulier dans les pays à revenu faible et intermédiaire. La perturbation des établissements de santé pour diagnostiquer et traiter la tuberculose pendant la pandémie de COVID-19 a eu un impact négatif sur l’incidence des nouveaux cas1. De plus, il est urgent de s’attaquer aux souches multirésistantes et très résistantes de M.tb, ainsi qu’à la co-infection de M.tb et du VIH pou.......
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Déclarations de divulgation
DP et PJGB déclarent que l’étude a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.
Remerciements
Ces travaux ont été financés par des fonds internes de la Faculté de médecine de l’Universidade Católica Portuguesa et des financements externes de la Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), dans le cadre des subventions UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 et EXPL/SAU-INF/0742/2021.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Plaques à 96 puits | VWR | 734-2781 | |
| Objectif reflex numérique 15-55 mm | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
| Appareil photo reflex numérique | Nikon | D3400 | |
| Objectif macro reflex numérique | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
| Sérum de veau fœtal | Gibco | 10270106 | |
| Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji est un logiciel open source soutenu par plusieurs laboratoires, institutions et particuliers. Tous les plugins nécessaires sont inclus. | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
| Pipette multicanaux (0,5 - 10 & micro ; l) | Pipette | Gilson FA10013 | |
| (20 - 200 & micro ; l) | Gilson | FA10011 | |
| Mycobacterium bovis BCG ; | American Type Culture Collection | ATCC35734 | souche TMC 1011 [BCG Pasteur] |
| Enrichissement OADC | BD | 211886 | |
| Saline tamponnée au phosphate (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
| Pyruvate de sodium | Gibco | 11360-070 | |
| Spectrophotomètre UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
| Boîte de Pétri carrée 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
| Bain à ultrasons Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |
Références
- World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2022. , World Health Organization. Geneva. (2022).
- Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. 100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine. Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).
- Bettencourt, P. J. G.
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Réimpressions et autorisations
