通过亚型特异性视黄酸受体对活神经元线粒体稳态调节进行优化的自动分析
Summary
线粒体网络极其复杂，因此分析起来非常具有挑战性。一种新颖的MATLAB工具可分析延时摄影图像中的实时共聚焦成像线粒体，但输出量很大，需要单独手动操作。为了解决这个问题，开发了一个例行优化，允许快速的文件分析。
Abstract
复杂的线粒体网络使得分割、跟踪和分析活细胞变得非常具有挑战性。MATLAB 工具允许分析延时文件中的线粒体，从而大大简化和加快图像处理过程。尽管如此，现有工具产生的输出量很大，需要单独的手动关注，并且基本的实验设置有数千个文件的输出，每个文件都需要大量且耗时的处理。
为了解决这些问题，我们开发了一种例行优化，包括 MATLAB 代码和实时脚本形式，允许快速进行文件分析并显着减少文档读取和数据处理。以 100 个文件/分钟的速度，优化允许整体快速分析。优化通过在整个时间范围内对单个线粒体的特定帧数据进行平均，以定义的方式分析数据，与现有工具的输出一致，从而实现结果输出。使用染料四甲基罗丹明甲酯进行实时共聚焦成像，并通过用视黄酸受体 （RAR） 激动剂处理神经元细胞来验证常规优化，其对神经元线粒体的影响已在文献中确定。结果与文献一致，并允许进一步表征线粒体网络行为以响应亚型特异性 RAR 调节。
这种新方法可以快速和验证全神经元线粒体网络的表征，但它也允许区分轴突和细胞体线粒体，这是应用于神经科学领域的基本特征。此外，该协议可应用于使用速效治疗的实验，允许在治疗前后对相同的细胞进行成像，超越了神经科学领域。
Introduction
细胞线粒体位于所有生理状态的中心，透彻了解它们的稳态（有丝分裂）和行为对于帮助确定各种疾病（包括癌症和阿尔茨海默病）的药物治疗至关重要 1,2。
线粒体在能量稳态、ATP 生成、钙缓冲和 ROS 调节中起着至关重要的细胞作用，而有丝分裂对于维持蛋白质稳态至关重要，因为分子伴侣是能量依赖性的3。这些需要持续和动态的网络调制和适应才能有效地满足细胞需求，并且线粒体转运受不同信号通路的调节;以前的工作已经描述了一种这样的途径，即视黄酸受体 （RAR） 4,5。视黄酸 （RA） 通过 RAR 激活促进轴突和神经突的生长。在小鼠原代皮层神经元中，RAR-β 的激活可促进神经突中的线粒体生长、速度和活动性6。
考虑到线粒体网络的适应性和动态性，“实时”评估有丝分裂的可能性不仅对于研究能量稳态至关重要，而且对于蛋白稳态、细胞健康、增殖或信号传导也至关重要。评估有丝分裂的常用方法依赖于使用荧光染料或标记物突出线粒体后进行共聚焦显微镜检查，以及允许温度和/或 CO2 调节的特定显微镜设置7。这种类型的实验设置需要一次执行一个实验重复。除了不同处理的实验重复外，还应该考虑大多数实验应该有其技术重复（其中每个板对多个位置进行成像），并在一系列时间点中记录一系列焦平面（z-stacks）。因此，实验设计具有三个重复的一种对照和两种处理，每个板有五个成像位置和 15 个时间点，导致要处理 225 个堆栈。传统上，活线粒体的视频是通过绘制 kymographs 来分析的，这将单独分析8，这是一个耗时的过程，需要大量的手动输入，即使依赖计算机工具也是如此。
最近描述了一种算法9 ，该算法允许自动分割和跟踪活细胞2-D和3-D延时文件中的线粒体。其他定量技术可用，但都有其局限性10.Mitometer 是一种自动化的开源应用程序，特别适合时间流逝和线粒体动力学分析，需要很少的用户输入。与其他现有的基于MATLAB的工具相比，该应用程序具有一系列优势，即允许使用多达13个不同的参数自动处理单个TIF堆栈，这对神经科学特别感兴趣，因为它可以区分核周和远核线粒体。
但是，对于上述实验，应用于 225 个堆栈的这 13 个参数会产生 2,925 个单独的输出文件。这些需要四个单独的计算机输入，总共需要超过 10,000 个手动输入才能下载所有输出文件。对于大型实验设计，这会导致对每个文件和数据集成进行不必要的极其耗时的分析。在这里，我们提出了一个例行优化，允许快速的文件分析，大大减少文档阅读和数据处理，以定义的方式分析数据，与现有工具的输出一致。
Protocol
Representative Results
Discussion
活细胞成像产生的大文件需要大量的计算处理，但即使是最新的工具也需要大量的手动输入来处理。这种常规优化的重点是简化线粒体计上的线粒体分析过程，因为该工具在用户输入和数据输出之间实现了非常好的平衡。之前已经回顾了不同线粒体图像分析工具之间的全面比较10.虽然其他管道更侧重于分析线粒体网络和簇质量或分析膜电位变化，但这里介绍的这种新方法可以快?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
图像采集在 iBiMED 的 LiM 设施中进行，这是 PPBI（葡萄牙生物成像平台）的一个节点：POCI-01-0145-FEDER-022122。这项工作得到了 FCT （EXPL/BTM-SAL/0902/2021） LCF （CI21-00276）、教育与科学部科学与技术基金会 （2020.02006.CEECIND） 对 DT 的资助、ATG-Gabba 校友会对副总裁的资助以及阿威罗大学生物医学研究所-iBiMED 的资助。
Materials
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
References
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