ניתוח אוטומטי אופטימלי של אפנון הומאוסטזיס מיטוכונדריה עצבית חיה על ידי קולטני חומצה רטינואית ספציפיים לאיזופורם
Summary
הרשת המיטוכונדריאלית מורכבת ביותר, מה שהופך אותה למאתגרת מאוד לניתוח. כלי חדשני של MATLAB מנתח מיטוכונדריה עם תמונות קונפוקליות חיות בתמונות timelapse, אך התוצאה היא נפח פלט גדול הדורש תשומת לב ידנית אישית. כדי להתמודד עם בעיה זו, פותחה אופטימיזציה שגרתית, המאפשרת ניתוח קבצים מהיר.
Abstract
הרשת המיטוכונדריאלית המורכבת מאתגרת מאוד לפלח, לעקוב ולנתח תאים חיים. כלי MATLAB מאפשרים ניתוח מיטוכונדריה בקובצי timelapse, ובכך מפשטים ומאיצים באופן משמעותי את תהליך עיבוד התמונה. עם זאת, הכלים הקיימים מייצרים נפח פלט גדול, הדורש תשומת לב ידנית פרטנית, ולמערכי ניסוי בסיסיים יש פלט של אלפי קבצים, שכל אחד מהם דורש טיפול נרחב וגוזל זמן.
כדי להתמודד עם בעיות אלה, פותחה אופטימיזציה שגרתית, הן בקוד MATLAB והן בטופסי סקריפט חי, המאפשרת ניתוח קבצים מהיר ומפחיתה משמעותית את קריאת המסמכים ועיבוד הנתונים. עם מהירות של 100 קבצים לדקה, האופטימיזציה מאפשרת ניתוח מהיר כולל. המיטוב משיג את תפוקת התוצאות על ידי ממוצע נתונים ספציפיים למסגרת עבור מיטוכונדריה בודדים לאורך מסגרות זמן, ניתוח נתונים באופן מוגדר, עקבי עם אלה פלט מכלים קיימים. הדמיה קונפוקלית חיה בוצעה באמצעות הצבע טטרמתילרודאמין מתיל אסטר, והאופטימיזציה השגרתית אומתה על ידי טיפול בתאים עצביים עם אגוניסטים לקולטן חומצה רטינואית (RAR), שהשפעתם על מיטוכונדריה עצבית מבוססת בספרות. התוצאות תאמו את הספרות ואפשרו אפיון נוסף של התנהגות הרשת המיטוכונדריאלית בתגובה לאפנון RAR ספציפי לאיזופורם.
מתודולוגיה חדשה זו אפשרה אפיון מהיר ותקף של רשת מיטוכונדריה של נוירונים שלמים, אך היא גם מאפשרת הבחנה בין אקסון למיטוכונדריה של גוף התא, תכונה חיונית ליישום בתחום מדעי המוח. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על ניסויים באמצעות טיפולים מהירים, המאפשר הדמיה של אותם תאים לפני ואחרי טיפולים, מעבר לתחום מדעי המוח.
Introduction
מיטוכונדריה תאית ניצבת במרכז כל המצבים הפיזיולוגיים, והבנה מעמיקה של ההומאוסטזיס (מיטוסטזיס) והתנהגותם היא בעלת חשיבות עליונה כדי לסייע בזיהוי טיפול תרופתי למגוון רחב של מחלות, כולל סרטן ואלצהיימר 1,2.
מיטוכונדריה ממלאים תפקידים תאיים מכריעים בהומאוסטזיס אנרגיה, בייצור ATP, בחציצה של סידן ובוויסות ROS, ומיטוסטאזיס חיוני לשמירה על הומאוסטזיס חלבונים, שכן מלווים מולקולריים תלויים באנרגיה3. אלה דורשים אפנון רשת קבוע ודינמי והסתגלות כדי לענות ביעילות על הצרכים התאיים, והעברת המיטוכונדריה מווסתת על ידי מסלולי איתות שונים; עבודות קודמות תיארו מסלול אחד כזה, זה של קולטני חומצה רטינואית (RARs)4,5. חומצה רטינואית (RA) מקדמת צמיחה אקסונלית ועצבית באמצעות הפעלת RAR. בתאי עצב ראשוניים בקליפת המוח של עכברים, הפעלת RAR-β מעודדת גדילה מיטוכונדריאלית, מהירות וניידות בנוירוט6.
בהתחשב ביכולת ההסתגלות והדינמיקה של הרשת המיטוכונדריאלית, האפשרות להעריך מיטוסטזיס “בזמן אמת” חיונית לא רק לחקר הומאוסטזיס אנרגיה, אלא גם לפרוטאוסטזיס, בריאות התאים, שגשוג או איתות. שיטה נפוצה להערכת מיטוסטזיס מסתמכת על מיקרוסקופ קונפוקלי לאחר הדגשת מיטוכונדריה באמצעות צבע פלואורסצנטי או סמן, כמו גם מערך מיקרוסקופיה ספציפי המאפשר ויסות טמפרטורה ו / או CO2 7. סוג זה של מערך ניסיוני כרוך בכך שהעתק ניסיוני אחד יבוצע בכל פעם. בנוסף לחזרה ניסיונית על טיפולים שונים, יש לקחת בחשבון שלרוב הניסויים צריכים להיות העתקים טכניים שלהם (שבהם יותר ממיקום אחד מצולם לכל לוחית), עם סדרה של מישורי מוקד (ערימות z) המתועדים בסדרה של נקודות זמן. לפיכך, תכנון ניסיוני עם שלוש חזרות של בקרה אחת ושני טיפולים, עם חמש עמדות הדמיה לכל צלחת, ו -15 נקודות זמן, מביא לעיבוד של 225 ערימות. באופן קלאסי, סרטונים של מיטוכונדריה חיים נותחו על ידי שרטוט קימוגרפים, אשר ינותחו בנפרד8, בתהליך גוזל זמן הדורש קלט ידני נרחב, גם כאשר מסתמכים על כלי מחשב.
לאחרונה תואר אלגוריתם9 המאפשר פילוח ומעקב אוטומטיים אחר מיטוכונדריה בקבצים דו-ממדיים ותלת-ממדיים של תאים חיים. קיימות טכניקות כימות אחרות, ולכולן יש מגבלות10. מיטומטר, יישום קוד פתוח אוטומטי, מתאים במיוחד לניתוח דינמיקת מיטוכונדריה בחלוף זמן, הדורש קלט משתמש נמוך. ליישום זה יש שורה של יתרונות על פני כלים קיימים אחרים מבוססי MATLAB, כלומר מאפשר עיבוד אוטומטי של ערימות TIF בודדות, תוך שימוש בעד 13 פרמטרים שונים, מעניין במיוחד עבור מדעי המוח, שכן הוא מבדיל בין מיטוכונדריה פרי-גרעינית וטלה-גרעינית.
עם זאת, עבור ניסוי כמו זה שתואר לעיל, 13 פרמטרים אלה החלים על 225 ערימות מביאים ל- 2,925 קבצי פלט נפרדים. אלה דורשים ארבע כניסות מחשב נפרדות, המסכמות עד 10,000 קלטים ידניים הנדרשים כדי להוריד את כל קבצי הפלט. עבור עיצובים ניסיוניים גדולים, התוצאה היא ניתוח גוזל זמן רב שלא לצורך של כל שילוב קובץ ונתונים. כאן אנו מציגים אופטימיזציה שגרתית המאפשרת ניתוח קבצים מהיר, צמצום משמעותי של קריאת מסמכים ועיבוד נתונים, ניתוח נתונים באופן מוגדר, עקבי עם הפלט מהכלים הקיימים.
Protocol
Representative Results
Discussion
דימות תאים חי מייצר קבצים גדולים הדורשים עיבוד מחשוב רציני, אך אפילו הכלים העדכניים ביותר דורשים קלט ידני נרחב לעיבוד. אופטימיזציה שגרתית זו מתמקדת בפישוט תהליך ניתוח המיטוכונדריה במיטומטר מכיוון שכלי זה מציג איזון טוב מאוד בין קלט המשתמש לפלט הנתונים. השוואה מקיפה בין כלים שונים לניתוח …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
רכישת התמונה בוצעה במתקן LiM של iBiMED, צומת של PPBI (פלטפורמה פורטוגזית של BioImaging): POCI-01-0145-FEDER-022122. עבודה זו נתמכה על ידי FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276), מענק ל- DT מ- Fundação para a Ciência e Tecnologia of the Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), מענק מ- ATG-The Gabba Alumni Association לסמנכ”ל, והמכון לביו-רפואה-iBiMED, אוניברסיטת אביירו.
Materials
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
References
- Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and cancer. Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).
- Clare, D. K., Saibil, H. R. ATP-driven molecular chaperone machines. Biopolymers. 99 (11), 846-859 (2013).
- Tourniaire, F., et al. All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes. Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).
- Psarra, A. M., Sekeris, C. E. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).
- Trigo, D., Goncalves, M. B., Corcoran, J. P. T. The regulation of mitochondrial dynamics in neurite outgrowth by retinoic acid receptor beta signaling. FASEB Journal. 33 (6), 7225-7235 (2019).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 4 (Unit 4), 1-21 (2010).
- Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biology. 11 (12), e1001754 (2013).
- Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images. Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).
- Chu, C. -. H., Tseng, W. -. W., Hsu, C. -. M., Wei, A. -. C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 855775 (2022).
- Creed, S., McKenzie, M. Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
- Sahin, M., Oncu, G., Yilmaz, M. A., Ozkan, D., Saybasili, H. Transformation of SH-SY5Y cell line into neuron-like cells: Investigation of electrophysiological and biomechanical changes. Neuroscience Letters. 745, 135628 (2021).
- Trigo, D., et al. Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells. Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).
