Analisi automatizzata ottimizzata della modulazione dell'omeostasi dei mitocondri neuronali vivi da parte dei recettori dell'acido retinoico isoform-specifici
Summary
La rete mitocondriale è estremamente complessa, il che la rende molto difficile da analizzare. Un nuovo strumento MATLAB analizza i mitocondri confocali in tempo reale nelle immagini timelapse, ma produce un grande volume di output che richiede un’attenzione manuale individuale. Per risolvere questo problema, è stata sviluppata un’ottimizzazione di routine, che consente una rapida analisi dei file.
Abstract
La complessa rete mitocondriale rende molto difficile segmentare, seguire e analizzare le cellule vive. Gli strumenti MATLAB consentono l’analisi dei mitocondri in file timelapse, semplificando e velocizzando notevolmente il processo di elaborazione delle immagini. Ciononostante, gli strumenti esistenti producono un grande volume di output, che richiede un’attenzione manuale individuale, e le configurazioni sperimentali di base hanno un output di migliaia di file, ognuno dei quali richiede una gestione estesa e dispendiosa in termini di tempo.
Per risolvere questi problemi, è stata sviluppata un’ottimizzazione di routine, sia in codice MATLAB che in forma live-script, che consente una rapida analisi dei file e riduce significativamente la lettura e l’elaborazione dei dati. Con una velocità di 100 file/min, l’ottimizzazione consente un’analisi complessivamente rapida. L’ottimizzazione raggiunge l’output dei risultati calcolando la media dei dati specifici del frame per i singoli mitocondri in intervalli di tempo, analizzando i dati in modo definito, coerente con quelli degli strumenti esistenti. L’imaging confocale dal vivo è stato eseguito utilizzando il colorante tetrametilrodamina estere metilico e l’ottimizzazione di routine è stata convalidata trattando le cellule neuronali con agonisti del recettore dell’acido retinoico (RAR), i cui effetti sui mitocondri neuronali sono stabiliti in letteratura. I risultati sono stati coerenti con la letteratura e hanno permesso un’ulteriore caratterizzazione del comportamento della rete mitocondriale in risposta alla modulazione RAR isoforma-specifica.
Questa nuova metodologia ha permesso una caratterizzazione rapida e validata della rete mitocondriale dell’intero neurone, ma consente anche la differenziazione tra mitocondri assone e corpo cellulare, una caratteristica essenziale da applicare nel campo delle neuroscienze. Inoltre, questo protocollo può essere applicato a esperimenti che utilizzano trattamenti ad azione rapida, consentendo l’imaging delle stesse cellule prima e dopo i trattamenti, trascendendo il campo delle neuroscienze.
Introduction
I mitocondri cellulari sono al centro di tutti gli stati fisiologici e una comprensione approfondita della loro omeostasi (mitostasi) e del loro comportamento è fondamentale per aiutare a identificare il trattamento farmacologico per una vasta gamma di malattie, tra cui il cancro e il morbo di Alzheimer 1,2.
I mitocondri svolgono ruoli cellulari cruciali nell’omeostasi energetica, nella generazione di ATP, nel tamponamento del calcio e nella regolazione dei ROS, e la mitostasi è essenziale per mantenere l’omeostasi proteica poiché gli chaperoni molecolari sono dipendenti dall’energia3. Questi richiedono una modulazione e un adattamento di rete costanti e dinamici per soddisfare in modo efficiente le esigenze cellulari e il trasporto dei mitocondri è regolato da diverse vie di segnalazione; Lavori precedenti hanno descritto uno di questi percorsi, quello dei recettori dell’acido retinoico (RARs)4,5. L’acido retinoico (RA) promuove la crescita assonale e neuritica attraverso l’attivazione di RAR. Nei neuroni corticali primari del topo, l’attivazione di RAR-β incoraggia la crescita mitocondriale, la velocità e la mobilità nel neurite6.
Considerando l’adattabilità e la dinamica della rete mitocondriale, la possibilità di valutare la mitostasi in “tempo reale” è essenziale non solo per studiare l’omeostasi energetica, ma anche per la proteostasi, la salute cellulare, la proliferazione o la segnalazione. Un metodo comunemente usato per valutare la mitostasi si basa sulla microscopia confocale dopo aver evidenziato i mitocondri utilizzando un colorante o un marcatore fluorescente, nonché una configurazione di microscopia specifica che consente la regolazione della temperatura e/o della CO2 7. Questo tipo di configurazione sperimentale prevede l’esecuzione di una replica sperimentale alla volta. Oltre alla ripetizione sperimentale di diversi trattamenti, va considerato che la maggior parte degli esperimenti dovrebbe avere le proprie repliche tecniche (in cui viene ripresa più di una posizione per lastra), con una serie di piani focali (z-stack) registrati in una serie di punti temporali. Pertanto, un disegno sperimentale con tre ripetizioni di un controllo e due trattamenti, con cinque posizioni di imaging per piastra e 15 punti temporali, si traduce in 225 pile da elaborare. Classicamente, i video dei mitocondri vivi sono stati analizzati tracciando i kymografi, che sarebbero stati analizzati individualmente8, in un processo che richiedeva molto tempo e che richiedeva un ampio input manuale, anche quando ci si affidava a strumenti informatici.
Recentemente è stato descritto un algoritmo9 che consente la segmentazione e il tracciamento automatizzati dei mitocondri in file time-lapse 2D e 3D di cellule vive. Sono disponibili altre tecniche di quantificazione, e tutte hanno i loro limiti10. Mitometer, un’applicazione open source automatizzata, è particolarmente adatta per l’analisi del time lapse e della dinamica dei mitocondri, richiedendo un basso input da parte dell’utente. Questa applicazione presenta una serie di vantaggi rispetto ad altri strumenti esistenti basati su MATLAB, ovvero la possibilità di elaborare automaticamente i singoli stack TIF, utilizzando fino a 13 parametri diversi, particolarmente interessante per le neuroscienze, in quanto differenzia tra mitocondri peri- e tele-nucleari.
Tuttavia, per un esperimento come quello sopra descritto, questi 13 parametri applicati a 225 stack danno come risultato 2.925 singoli file di output. Questi richiedono quattro input individuali del computer, che sommano oltre 10.000 input manuali necessari per scaricare tutti i file di output. Per i progetti sperimentali di grandi dimensioni, ciò si traduce in un’analisi inutilmente estremamente dispendiosa in termini di tempo di ogni file e integrazione dei dati. Qui presentiamo un’ottimizzazione di routine che consente una rapida analisi dei file, riducendo notevolmente la lettura dei documenti e l’elaborazione dei dati, analizzando i dati in modo definito, coerente con l’output degli strumenti esistenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’imaging di cellule vive produce file di grandi dimensioni che richiedono una seria elaborazione informatica, ma anche gli strumenti più recenti richiedono un ampio input manuale per l’elaborazione. Questa ottimizzazione di routine si concentra sulla semplificazione del processo di analisi dei mitocondri sul mitometro perché questo strumento presenta un ottimo equilibrio tra l’input dell’utente e l’output dei dati. In precedenza è stato esaminato un confronto completo tra diversi strumenti per l’analisi delle immagin…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’acquisizione delle immagini è stata eseguita nella struttura LiM di iBiMED, un nodo di PPBI (Piattaforma Portoghese di BioImaging): POCI-01-0145-FEDER-022122. Questo lavoro è stato sostenuto da FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021), LCF (CI21-00276), una sovvenzione a DT dalla Fundação para a Ciência e Tecnologia del Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), una sovvenzione da ATG-The Gabba Alumni Association a VP e dall’Istituto di Biomedicina-iBiMED, Università di Aveiro.
Materials
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
References
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