Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification i Saccharomyces cerevisiae

Summary

Denne protokollen presenterer en locus-spesifikk kromatinisolasjonsmetode basert på stedsspesifikk rekombinasjon for å rense et enkeltkopigenlokus av interesse i sin opprinnelige kromatinkontekst fra spirende gjær, Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Den grunnleggende organisatoriske enheten av eukaryot kromatin er nukleosomkjernepartikkelen (NCP), som består av DNA pakket ~ 1, 7 ganger rundt en histonoktamer. Kromatin er definert som enheten av NCP og mange andre proteinkomplekser, inkludert transkripsjonsfaktorer, kromatinremodellering og modifiserende enzymer. Det er fortsatt uklart hvordan disse protein-DNA-interaksjonene orkestreres på nivået av spesifikke genomiske loci under forskjellige stadier av cellesyklusen. Dette skyldes hovedsakelig de nåværende tekniske begrensningene, som gjør det utfordrende å oppnå presise målinger av slike dynamiske interaksjoner. Her beskriver vi en forbedret metode som kombinerer stedsspesifikk rekombinasjon med en effektiv ett-trinns affinitetsrensingsprotokoll for å isolere et enkeltkopigenlokus av interesse i sin opprinnelige kromatintilstand. Metoden muliggjør robust anrikning av mållokuset over genomisk kromatin, noe som gjør denne teknikken til en effektiv strategi for å identifisere og kvantifisere proteininteraksjoner på en objektiv og systematisk måte, for eksempel ved massespektrometri. I tillegg til slike sammensetningsanalyser vil naturlig kromatin renset med denne metoden sannsynligvis reflektere in vivo-situasjonen med hensyn til nukleosomposisjonering og histonmodifikasjoner, og er derfor egnet til ytterligere strukturelle og biokjemiske analyser av kromatin avledet fra praktisk talt ethvert genomisk locus i gjær.

Introduction

Den dynamiske organisasjonen av eukaryote genomer i kromatin komprimerer DNA for å passe innenfor rammen av kjernen, samtidig som det sikres tilstrekkelig dynamikk for genuttrykk og tilgjengelighet for regulatoriske faktorer. Delvis er denne allsidigheten formidlet av nukleosomet, den grunnleggende enheten av kromatin, som består av en kjernepartikkel med 147 bp DNA pakket ~ 1, 7 ganger rundt histonoktameren¹. Nukleosomet er en svært dynamisk struktur med hensyn til sammensetningen, med mange histonvarianter og posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) på N- og C-terminale histonhaler. Videre interagerer eukaryot kromatin med en rekke andre viktige komponenter, for eksempel transkripsjonsfaktorer, DNA- og RNA-behandlingsmaskiner, arkitektoniske proteiner, enzymer involvert i kromatinremodellering og modifikasjon, og RNA-molekyler assosiert med kromatin. Disse viktige machineries involvert i transkripsjon, replikering og reparasjon alle krever tilgang til kromatin, som fungerer som det naturlige substratet for disse prosessene. Følgelig krever forståelsen av de molekylære mekanismene som ligger til grunn for disse DNA-transaksjonene en presis definisjon av de kollektive endringene i kromatinstrukturen i de spesifikke genomiske regionene der disse maskinene konvergerer og letter biologiske reaksjoner.

Til tross for identifisering av mange kromatinfaktorer gjennom genetikk- og protein-proteininteraksjonsstudier, har det fortsatt vært en betydelig hindring å utføre direkte, objektive og omfattende analyser av kromatininteraksjoner på bestemte genomiske steder ^2,3. I utgangspunktet kunne bare svært tallrike regioner av genomet (dvs. repeterende loci) eller multikopiplasmider isoleres i tilstrekkelige mengder og renhet for massespektrometrisk identifikasjon av de assosierte proteinene 4,5,6,7. En rekke nye tilnærminger basert på direkte hybridisering av fangstprober til kromatinisert DNA, nærhetsbiotinylering ved hjelp av CRISPR-dCas9-systemet, eller binding av sekvensspesifikke adapterproteiner til stedet av interesse har begynt å avdekke proteomet til enkeltkopi-loci fra gjær- og pattedyrgenomer ^8,9,10. Imidlertid krever alle disse metodene formaldehyd-tverrbinding for å stabilisere protein-DNA-interaksjonene og sonikering for å solubilisere kromatinet for etterfølgende rensing. Sammen utelukker begge manipulasjonene muligheten for etterfølgende strukturelle og funksjonelle studier av det rensede kromatinet.

For å overvinne disse begrensningene utviklet vi tidligere en metodikk som bruker stedsspesifikk rekombinasjon for å trekke ut målrettede kromosomale domener fra gjær^11,12. I hovedsak er den genomiske regionen av interesse omgitt av anerkjennelsessteder (RS) for den stedsspesifikke R-rekombinasen fra Zygosaccharomyces rouxi, samtidig som den inkorporerer en gruppe på tre DNA-bindingssteder for det prokaryote transkripsjonsrepressoren LexA-protein (LexA) i samme region. Gjærcellene inneholder en ekspresjonskassett for samtidig ekspresjon av R-rekombinase og et LexA-protein fusjonert til en tandem affinitetsrensing (TAP) tag. Etter induksjon av R-rekombinase fjerner enzymet effektivt det målrettede området fra kromosomet i form av et sirkulært kromatindomene. Dette domenet kan renses via LexA-TAP-adapterproteinet, som binder seg til LexA DNA-bindingsstedene, samt til en affinitetsstøtte. Denne metoden har nylig blitt brukt til å isolere forskjellige kromatindomener som inneholder utvalgte replikasjonsopprinnelser av gjærkromosom III¹³.

En stor fordel med denne ex vivo-tilnærmingen er at den muliggjør funksjonelle analyser av det isolerte materialet. For eksempel kan replikasjonsopprinnelsesdomener renset med denne metoden bli utsatt for in vitro-replikasjonsanalyser for å vurdere effektiviteten av opprinnelsesfyring i et reagensrør fra innfødte in vivo-monterte kromatinmaler. Til slutt kan den biokjemiske og funksjonelle karakteriseringen av det isolerte materialet tillate rekonstituering av nukleære prosesser ved bruk av rensede proteiner sammen med den opprinnelige kromatinmalen. Oppsummert åpner denne metoden en spennende vei i kromatinforskning, da det vil være mulig å følge de kollektive sammensetnings- og strukturelle kromatinendringene i en bestemt genomisk region som gjennomgår en viss kromosomal transaksjon.

Protocol

Se materialfortegnelsen for detaljer knyttet til alle materialer og instrumenter som brukes i denne protokollen. Se tabell 1 for en liste over løsningene, bufferne og mediene som brukes. 1. Rekombinant gjærstammekonstruksjon For å konstruere en rekombinasjonskompetent gjærstamme, transformer SbfI-fordøyd plasmid K238 til en gjærstamme med integrerte LexA-bindingssteder og RS-rekombinasjonssteder ved stedet av interesse<sup clas…

Representative Results

Rensingen av ~1,4 kb ARS316-kromatindomenet ble mediert av det konstitutivt uttrykte LexA-TAP-adapterproteinet. For å tjene som en negativ kontroll, utførte vi rensinger ved hjelp av en isogen stamme som uttrykker LexA-TAP, men inneholder ikke integrerte RS- og LexA-bindingssteder. Figur 3 illustrerer DNA-analyseresultatet fra et standard renseeksperiment utført på både kontroll- og en rekombinasjonskompetent stamme rettet mot ARS316-lokuset. Etter DNA-isolering og restriksjonsenzymford…

Discussion

Identifiseringen av faktorene og kromatinlandskapet i en bestemt målgenomisk region fortsetter å utgjøre en stor utfordring i kromatinforskning¹⁸. Denne protokollen beskriver et effektivt system for å spesifikt skjære ut og rense forskjellige kromatindomener fra gjærkromosomer. Så vidt vi vet, overvinner renheten og utbyttet av denne ett-trinns rensingen mange av begrensningene i locus-spesifikke kromatinrensingsmetoder, og muliggjør dermed oppnåelse av svært høy anrikning av de målret…

Materials

Yeast strains
Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR			Section 1, see references 13 and 14
Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR			Section 1, see reference 13 and 14
Plasmid
K238 plasmid			Section 1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C
K071 Spike-in plasmid DNA			Section 7.1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C
Reagents
Acetone	Carl Roth	5025.1	Section 2 Storage: Store at room temperature
Ammonium acetate (NH4Ac)	Sigma Aldrich	A7262	Section 6 and 7.1 Storage: Store at room temperature
Ammonium solution (NH4OH) 25%	Merck Millipore	533003	Section 6 Storage: Store at room temperature
Ammonium sulfate	Santa Cruz	Sc-29085	Section 2 Storage: Store at room temperature
Bacto agar	BD (VWR)	90000-760	Section 3 Storage: Store at room temperature
Bacto peptone	BD (VWR)	211820	Section 3 Storage: Store at room temperature
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	07604	Section 7.2 Storage: Store at 4 °C
Chemiluminescent substrate kit	ThermoFisher	34580	Section 7.2 Storage: Store at 4 °C
Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate	Merck	1.06579.1000	Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher	15508013	Section 4 Storage: Store at 4 °C
Ethanol	Merck	100983	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	ED	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Galactose (20% (w/v) stock)	Sigma Aldrich	G0625-1KG  /  5KG	Section 3 Storage: Store at room temperature
Gel loading dye (6x)	BioLabs	B7024A	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
Glusose	Sigma-Aldrich	G8270	Section Storage: Store at room temperature
Glycine	Carl Roth	.0079.4	Section 2 Storage: Store at room temperature
Glycogen (5 mg/mL)	Invitrogen	AM9510	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl)	PanReac AppliChem	182109.1211	Section 2, 4 and 7.1 Storage: Store at room temperature
Magnesium Acetate (MgAc)	Bernd Kraft	15274.2600/C035	Section 4 Storage: Store at room temperature
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma Aldrich	M8266	Section 6 Storage: Store at room temperature
Nu PAGE LDS sample buffer (4x)	Invitrogen	2399549	Section 7.2 Storage: Store at room temperature
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v)	Invitrogen	15593-031	Section 7.1 Storage: Store at 4 °C
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P9541	Section 4 Storage: Store at room temperature
Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL)	Hartmann Analytic	SRP-203	Section 7.1 Storage: Store at 4 °C
RadPrime labeling system	ThermoFisher	18428-011	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
Raffinose (20% (w/v) stock)	SERVA	34140.03	Section 3 Storage: Store at room temperature
Sodium chloride (NaCl)	Merck	K53710504142	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium citrate (Na3C6H5O7)	Sigma-Aldrich	71402	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S5881	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) )	Alfa Aesar	A11183	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	71496	Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature
Sodium azide	Santa Cruz Biotechnology	sc-208393	Section 2 Storage: Store at -20 °C
Triethylamine	Sigma Aldrich	90340	Section 2 Storage: Store at room temperature
Tris base	Chem Cruz	SC-3715B	Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature
Tween-20	Bernd Kraft	18014332	Section 4 Storage: Store at room temperature
Yeast extract	BD (VWR)	212720	Section 3 Storage: Store at room temperature
Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock )	Biomol	Y2016.5	Section 3 Storage: Store at -20 °C
Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE	Sigma Aldrich	Y1376	Section 1, see reference 14
Enzymes
HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL)	NEB	R0105S	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x)	ThermoFisher Scientific	78446	Section 4 Storage: Store at4 °C
Proteinase K (10 mg/mL)	SERVA	33756	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
RNase A (10 mg/mL)	ThermoFisher	EN0531	Section 7.1 Storage: Store at -20 °C
TEV protease (10000 U/µL)	NEB	P8112S	Section 5 Storage: Store at -20 °C
Materials
BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads	Bioclone Inc.	FC-102	Section 2 Storage: Store at 4 °C
Dry ice			Section 4
Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL	Eppendorf	22431102	Section 4
Microspin G-25 Columns	Cytiva	27-5325-01	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Parafilm	Merck	P7793	Section 4
Positive nylon membrane	Biozol	11MEMP0001	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
PVDF transfer membrane	Immobilon-Merck Millipore	IPVH00010	Section 7.2 Storage: Store at room temperature
SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm)	Invitrogen	NP0336BOX	Section 7.2 Storage: Store at 4 °C
Syringe (25 mL) with luer fitting	Henke Sass Wolf	4200-000V0	Section 3
Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet)	Cytiva	3030-917	Section 7.1 Storage: Store at room temperature
Antibodies
Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody	Merck Millipore	06-719	Section 7.2 Storage: Store at -20 °C
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate	Invitrogen	G21234	Section 7.2 Storage: Store at -20 °C
Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins	Sigma Aldrich	P1291-500UL	Section 7.2 Storage: Store at -20 °C
Rabbit IgG antibodies	Sigma	I5006-100MG	Section 2 Storage: Store at 4 °C
Primers (10 µM)
ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT			Section 7.1
K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT			Section 7.1
PCR fragment from yeast genomic DNA as a template  for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT                                                  rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT			Section 7.1
PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT			Section 7.1
Equipment
Coffee grinder	Gastroback	42601	Section 4
Dewar flask	NAL GENE	4150-2000	Section 3
DynaMag TM-2 magnetic rack	Invitrogen	12321D	Section 4, 5 and 6
Hybridization oven	Hybaid Mini10	Ri418	Section 2
Microcentrifuge	Eppendorf	5424R	Section 4 and 7.1
UV-crosslinker	Analytikjena	95-0174-02	Section 7.1