Hochdurchsatz-Behavioralitäts- und Lifespan-Assays mit der Lifespan Machine

Summary

Die Bildgebungsplattform “The Lifespan Machine” automatisiert die lebenslange Beobachtung großer Populationen. Wir zeigen die Schritte, die erforderlich sind, um Lebensdauer-, Stressresistenz-, Pathogenese- und Verhaltensalterungstests durchzuführen. Die Qualität und der Umfang der Daten ermöglichen es den Forschern, Interventionen beim Altern trotz des Vorhandenseins biologischer und umweltbedingter Variationen zu untersuchen.

Abstract

Genetisch identische Tiere, die in einer konstanten Umgebung gehalten werden, weisen eine breite Verteilung der Lebensspanne auf, was einen großen nicht-genetischen, stochastischen Aspekt des Alterns widerspiegelt, der in allen untersuchten Organismen konserviert ist. Diese stochastische Komponente bedeutet, dass Forscher große Populationen von Versuchstieren gleichzeitig überwachen müssen, um das Altern zu verstehen und erfolgreiche Interventionen zu identifizieren, die die Lebensdauer verlängern oder die Gesundheit verbessern. Die herkömmliche manuelle Sterbebewertung begrenzt den Durchsatz und die Skalierung, die für groß angelegte Hypothesentests erforderlich sind, was zur Entwicklung automatisierter Methoden für Hochdurchsatz-Lebensdauer-Assays führt. Die Lifespan Machine (LSM) ist eine Hochdurchsatz-Bildgebungsplattform, die modifizierte Flachbettscanner mit kundenspezifischer Bildverarbeitungs- und Datenvalidierungssoftware für die lebenslange Verfolgung von Nematoden kombiniert. Die Plattform stellt einen großen technischen Fortschritt dar, indem sie hochgradig zeitlich aufgelöste Lebensspannendaten von großen Tierpopulationen in einem noch nie dagewesenen Umfang und mit einer statistischen Präzision und Genauigkeit generiert, die manuellen Assays von erfahrenen Forschern entspricht. In jüngster Zeit wurde das LSM weiterentwickelt, um die während des Alterns beobachteten Verhaltens- und morphologischen Veränderungen zu quantifizieren und sie mit der Lebensspanne in Beziehung zu setzen. Hier beschreiben wir, wie ein automatisiertes Lebensdauerexperiment mit dem LSM geplant, durchgeführt und analysiert wird. Darüber hinaus heben wir die kritischen Schritte hervor, die für die erfolgreiche Erhebung von Verhaltensdaten und qualitativ hochwertigen Überlebenskurven erforderlich sind.

Introduction

Das Altern ist ein komplexer, vielschichtiger Prozess, der durch eine Abnahme der physiologischen Funktion eines Organismus gekennzeichnet ist, was im Laufe der Zeit zu einem Anstieg des Krankheits- und Sterberisikos führt¹. Die Lebensspanne, gemessen als die Zeit von der Geburt oder dem Beginn des Erwachsenenalters bis zum Tod, liefert ein eindeutiges Ergebnis des Alterns² und einen indirekten, aber streng quantitativen Proxy für die Messung der relativen Alterungsrate zwischen Populationen³. Alternsstudien beruhen oft auf genauen Messungen der Lebensspanne, ähnlich wie bei klinischen Studien, um die Ergebnisse zwischen einer Population, die einer Intervention ausgesetzt war, und einer nicht exponierten Kontrollgruppe zu vergleichen. Leider durchdringt die Alternsforschung Probleme mit der Reproduzierbarkeit, manchmal aufgrund statistisch unterdurchschnittlicher Experimente⁴ und oft aufgrund der inhärenten Empfindlichkeit von Lebensspannen-Assays gegenüber subtilen Schwankungen in der Umwelt⁵. Robuste Experimente erfordern mehrere Replikate großer Populationen, und dieser Prozess profitiert besonders von der experimentellen Skalierbarkeit, die die Automatisierung⁶ bietet.

Die strengen Anforderungen von Lifespan-Assays ergeben sich aus der Unvorhersehbarkeit des Alterungsprozesses selbst. Isogene Individuen, die in identischen Umgebungen untergebracht sind, weisen unterschiedliche Sterbezeiten und physiologische Abbauraten auf⁷, was darauf hindeutet, dass die Lebensspanne ein hohes Maß an Stochastizität beinhaltet ^7,8. Daher sind große Populationen erforderlich, um quantitative Veränderungen im Alterungsprozess, wie z. B. Veränderungen der mittleren oder maximalen Lebenserwartung, zu messen und Verzerrungen zu überwinden, die sich aus individueller Variabilität ergeben. Darüber hinaus ist die Kapazität für Hochdurchsatz-Lebensdauer-Assays von entscheidender Bedeutung, um Studien von Überlebenskurvenformen und Modellen der Dynamik des Alterns zu unterstützen⁹.

Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist aufgrund seiner kurzen Lebensspanne, seiner genetischen Nachlässigkeit und seiner schnellen Generationszeit ein unschätzbares Modell für die Alternsforschung, was seine Eignung für Hochdurchsatz-Alterungs- und Lebensdauer-Assays unterstreicht. Traditionell ist die Lebensdauer in C. elegans wurde gemessen, indem man eine synchronisierte, kleine Population von etwa 50-100 Tieren über einen längeren Zeitraum auf festen Medien verfolgte und den Zeitpunkt der einzelnen Todesfälle aufschrieb. Wenn die Tiere älter werden und an Beweglichkeit verlieren, müssen die Tiere einzeln angestoßen und auf kleine Bewegungen des Kopfes oder Schwanzes überprüft werden, um die Sterbezeit manuell zu ermitteln. Dies ist in der Regel ein langwieriger und mühsamer Prozess, obwohl Anstrengungen unternommen wurden, um ihn zu beschleunigen 10,11,12. Wichtig ist, dass langsame experimentelle Pipelines den Fortschritt in unserem Verständnis des Alterns und der Wirksamkeit getesteter Interventionen behindern.

Um den Anforderungen der Alternsforschung an quantitative Daten gerecht zu werden, wurden viele Technologien zur Automatisierung der Datenerfassung entwickelt, darunter eine bemerkenswerte Bandbreite an Ansätzen, von mikrofluidischen Kammern bis hin zu Flachbettscannern 13,14,15,16,17,18. Das LSM unterscheidet sich von anderen Methoden durch seine umfassende Optimierung für die Erfassung hochpräziser und genauer Lebensdauerdaten, die durch die Entwicklung sorgfältiger Gerätekalibrierungsprotokolle in Kombination mit einer umfangreichen Software-Suite erreicht wird, die es den Benutzern ermöglicht, automatisierte Analysen zu validieren, zu korrigieren und zu verfeinern¹³. Obwohl die Software im Prinzip auf verschiedene Bildgebungsmodalitäten angewendet werden kann, verwenden die meisten Benutzer in der Praxis Flachbettscanner, die so modifiziert sind, dass sie eine fein abgestimmte Kontrolle über die Umgebungstemperatur und die Luftfeuchtigkeit ermöglichen – Faktoren, die aufgrund ihres großen Einflusses auf die Lebensdauer von entscheidender Bedeutung sind¹⁹. Das LSM nimmt alle 20 Minuten Bilder von Nematoden in Intervallen von Tagen bis Monaten auf, abhängig von den Umweltbedingungen und dem Genotyp. Die erzeugten Daten haben eine viel höhere zeitliche Auflösung als Daten aus manuellen Assays, und die gesammelten Bilder bieten eine dauerhafte visuelle Aufzeichnung der Nematodenposition über die gesamte Lebensspanne. Mittels Methoden des maschinellen Lernens werden jedem Einzelnen automatisch Sterbezeiten zugeordnet. Diese Ergebnisse können schnell und manuell mit einer Client-Software namens “Worm Browser” validiert werden. Aufgrund seiner Hard- und Software kann das LSM Überlebenskurven erstellen, die statistisch nicht von der manuellen Todesbewertung durch erfahrene Forscher zu unterscheiden sind, mit dem zusätzlichen Vorteil einer geringeren Arbeitsbelastung und einer höheren Skalierbarkeit¹³.

Die neueste Version des LSM ermöglicht auch die Untersuchung des Verhaltensalters, indem morphologische und verhaltensbezogene Daten während des gesamten Lebens des Fadenwurms gesammelt und zusammen mit der Lebensspanne jedes Individuums gemeldet werden. Insbesondere erfasst das LSM den Zeitpunkt der kräftigen Bewegungsbeendigung (VMC) jedes Tieres, ein Meilenstein, der häufig verwendet wird, um die “Gesundheitsspanne” eines Individuums im Unterschied zu seiner Lebensspanne zu quantifizieren. Durch die gleichzeitige Erfassung von Daten zur Lebensspanne und zum Verhalten des Alterns unterstützt das LSM die Untersuchung von Interventionen, die unterschiedliche Auswirkungen auf verschiedene phänotypische Ergebnisse des Alterns haben können²⁰. Eine Vielzahl von makroskopisch beobachtbaren Phänotypen kann verwendet werden, um die Verhaltensalterung zu untersuchen, wie z. B. Körperbewegung oder Pharynxpumpen²¹, Gewebeintegrität²² und Bewegungsgeschwindigkeit oder stimulusinduziertes Drehen¹⁷. Vergleiche zwischen verschiedenen Alterungsphänotypen können Analysen der kausalen Struktur von Alterungsprozessen unterstützen. Zum Beispiel wurde kürzlich der Vergleich zwischen VMC und Lebensspanne verwendet, um zwei unterschiedliche Alterungsprozesse in C. elegans zu charakterisieren²³.

Obwohl das LSM ursprünglich entwickelt wurde, um die Lebensdauer von C. elegans zu messen, unterstützt es die Erfassung von Überlebens- und Verhaltensdaten von einer Reihe von Nematodenarten, einschließlich C. briggsae, C. tropicalis, C. japonica, C. brenneri und P. Pacificus²³. Die Technologie erleichtert die Untersuchung der Auswirkungen biologischer und umweltbedingter Eingriffe auf die Lebensdauer, Stressresistenz und Resistenz gegen Krankheitserreger und kann mit experimentellen Werkzeugen wie gezielten Assays der RNA-Interferenz oder Auxin-induzierbaren Proteinabbausystemen gekoppelt werden. Bis heute wird es in der wissenschaftlichen Literatur für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet 6,24,25,26,27,28,29,30.

Hier skizzieren wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Durchführung eines Lifespan Machine-Experiments mit Agarplatten, von den Anfangsphasen des Versuchsaufbaus bis zur Ausgabe der resultierenden Überlebenskurven. Eine Besonderheit des LSM ist, dass der Aufwand stark frontlastig ist, was bedeutet, dass der Großteil der Zeit des Forschers während des Versuchsaufbaus und zu einem geringen Teil auch während der Post-Bildaufnahme aufgewendet wird. Die Datenerfassung ist für die gesamte Dauer des Experiments vollständig automatisiert und ermöglicht dem Forscher eine “freihändige” Erfahrung. Die hier beschriebenen Schritte gelten für viele verschiedene Arten von Überlebensassays – derselbe Versuchsaufbau wird für Lebensdauer-, Thermotoleranz-, oxidativen Stress- und Pathogenese-Assays durchgeführt. Im Abschnitt “Repräsentative Ergebnisse” diskutieren wir eine Teilmenge von Daten aus einem kürzlich veröffentlichten Manuskript, um die Effektivität der Analyse-Pipeline zu veranschaulichen und die wichtigsten Schritte während der Bildanalyse^{hervorzuheben 23}.

Protocol

1. Software- und Hardwareanforderungen Flachbettscanner: Prinzipiell kann der LSM mit einer Vielzahl von bildgebenden Geräten realisiert werden. Detaillierte Anweisungen für Scanner-Modifikationen und Fokussierung finden Sie an anderer Stelle13. Die LSM-Hardware ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Datenanalyse-Tools: Die LSM-Software besteht aus drei interagierenden Komponenten: einem Linux-basierten Softwarepaket für die Scanne…

Representative Results

Die experimentelle Reproduzierbarkeit in Lifespan-Assays ist eine Herausforderung und erfordert sowohl streng kontrollierte Versuchsbedingungen als auch große Populationen, um eine ausreichende statistische Auflösung zu erreichen 4,36. Das LSM eignet sich hervorragend für die Erfassung großer Tierpopulationen in einer konstanten Umgebung mit hoher zeitlicher Auflösung. Um die Leistungsfähigkeit des LSM zu demonstrieren, die entscheidenden Schritte der Analy…

Discussion

Hier stellen wir ein detailliertes, zugängliches Protokoll für die Durchführung eines Experiments mit der neuesten Version der Lifespan Machine zur Verfügung. Wir haben gezeigt, dass der entscheidende Schritt für das Erreichen gut aufgelöster Überlebenskurven der manuelle Ausschluss von Nicht-Wurm-Objekten während der Post-Bild-Aufnahme ist. Die manuelle Sterbezeit-Annotation hat einen geringen Einfluss auf die Gesamtform der Überlebenskurven und zeigt, dass die vollautomatische Sterbezeit-Schätzung auch ohne m…

Materials

1-Naphtaleneacetic  acid (Auxin)	Sigma	N0640	Solubilize Auxin in 1M potassium hydroxide and add into molten agar
5-fluoro-2-deoxyuridine (FUDR)	Sigma	F0503	27.5 μg/mL of FUDR was used to eliminate progeny from populations on UV-inactivated bacteria
Glass cleaner	Kristal-M	QB-KRISTAL-M125ml
Hydrophobic anti-fog glass treatment	Rain-X Scheibenreiniger	C. 059140
Rubber matt	Local crafstman		Cut on a high-strength EPDM rubber sheet stock
Scanner glass	Local hardware supplier		9" x 11.5" inch glass sheet
Scanner plates	Life Sciences	351006	50 mm x 9 mm, polystyrene petri dish
USB Reference Thermometer	USB Brando	ULIFE055500	For calibrating temperature of scanners