Saggi sull'invecchiamento comportamentale e sulla durata della vita ad alto rendimento utilizzando la macchina per la durata della vita

Summary

La piattaforma di imaging “The Lifespan Machine” automatizza l’osservazione permanente di grandi popolazioni. Mostriamo i passaggi necessari per eseguire saggi sulla durata della vita, sulla resistenza allo stress, sulla patogenesi e sull’invecchiamento comportamentale. La qualità e la portata dei dati consentono ai ricercatori di studiare gli interventi sull’invecchiamento nonostante la presenza di variazioni biologiche e ambientali.

Abstract

Gli animali geneticamente identici tenuti in un ambiente costante mostrano un’ampia distribuzione della durata della vita, riflettendo un grande aspetto stocastico non genetico dell’invecchiamento conservato in tutti gli organismi studiati. Questa componente stocastica significa che per comprendere l’invecchiamento e identificare interventi di successo che prolungano la durata della vita o migliorano la salute, i ricercatori devono monitorare contemporaneamente grandi popolazioni di animali da esperimento. Il tradizionale punteggio manuale dei decessi limita la produttività e la scala necessarie per i test di ipotesi su larga scala, portando allo sviluppo di metodi automatizzati per i saggi ad alta produttività. Lifespan Machine (LSM) è una piattaforma di imaging ad alto rendimento che combina scanner piani modificati con software di elaborazione delle immagini e convalida dei dati personalizzati per il monitoraggio dei nematodi per tutta la vita. La piattaforma costituisce un importante progresso tecnico in quanto genera dati sulla durata della vita altamente risolti temporalmente da grandi popolazioni di animali su una scala senza precedenti e con una precisione statistica e un’accuratezza pari ai saggi manuali eseguiti da ricercatori esperti. Recentemente, l’LSM è stato ulteriormente sviluppato per quantificare i cambiamenti comportamentali e morfologici osservati durante l’invecchiamento e metterli in relazione con la durata della vita. In questo articolo viene descritto come pianificare, eseguire e analizzare un esperimento automatizzato sulla durata della vita utilizzando LSM. Evidenziamo inoltre i passaggi critici necessari per il successo della raccolta di dati comportamentali e curve di sopravvivenza di alta qualità.

Introduction

L’invecchiamento è un processo complesso e sfaccettato, caratterizzato da un declino della funzione fisiologica di un organismo, che porta ad un aumento del rischio di malattia e morte nel tempo¹. La durata della vita, misurata come il tempo che intercorre tra la nascita o l’inizio dell’età adulta fino alla morte, fornisce un risultato inequivocabile dell’invecchiamento² e un indicatore indiretto ma rigorosamente quantitativo per misurare il tasso relativo di invecchiamento tra le popolazioni³. Gli studi sull’invecchiamento spesso dipendono da misurazioni accurate della durata della vita, simili agli studi clinici, per confrontare i risultati tra una popolazione esposta a un intervento e un gruppo di controllo non esposto. Sfortunatamente, i problemi di riproducibilità pervadono la ricerca sull’invecchiamento, a volte a causa di esperimenti statisticamente sottodimensionati⁴ e spesso a causa della sensibilità intrinseca dei saggi sulla durata della vita a sottili variazioni nell’ambiente⁵. Gli esperimenti robusti richiedono repliche multiple di grandi popolazioni e questo processo beneficia in particolare della scalabilità sperimentale offerta dall’automazione⁶.

Le rigorose esigenze dei saggi sulla durata della vita derivano dall’imprevedibilità del processo di invecchiamento stesso. Gli individui isogenici ospitati in ambienti identici mostrano tempi di morte e tassi di declino fisiologico^{diversi 7}, suggerendo che la durata della vita comporta un alto grado di stocasticità ^7,8. Pertanto, le grandi popolazioni sono tenute a misurare i cambiamenti quantitativi nel processo di invecchiamento, come i cambiamenti nella durata media o massima della vita, e a superare le distorsioni derivanti dalla variabilità individuale. Inoltre, la capacità di saggi ad alto rendimento sulla durata della vita è fondamentale per supportare gli studi sulle forme delle curve di sopravvivenza e sui modelli delle dinamiche dell’invecchiamento⁹.

Il nematode Caenorhabditis elegans è un modello inestimabile per la ricerca sull’invecchiamento grazie alla sua breve durata di vita, alla trattabilità genetica e al rapido tempo di generazione, che sottolineano la sua idoneità per saggi di invecchiamento e durata della vita ad alto rendimento. Tradizionalmente, la durata della vita in C. Elegans è stato misurato seguendo una piccola popolazione sincronizzata di circa 50-100 animali nel tempo su supporti solidi e annotando il tempo delle singole morti. Man mano che gli animali invecchiano e perdono mobilità, è necessario valutare manualmente i tempi di morte e controllare individualmente gli animali e controllare i piccoli movimenti della testa o della coda. Questo è di solito un processo noioso e laborioso, anche se sono stati fatti sforzi per accelerarlo 10,11,12. È importante sottolineare che la lentezza delle pipeline sperimentali ostacola i progressi nella nostra comprensione dell’invecchiamento e dell’efficacia degli interventi testati.

Per soddisfare le esigenze della ricerca sull’invecchiamento per i dati quantitativi, sono state sviluppate molte tecnologie per automatizzare la raccolta dei dati, tra cui una notevole gamma di approcci, dalle camere microfluidiche agli scanner piani 13,14,15,16,17,18. L’LSM si differenzia dagli altri metodi per la sua ampia ottimizzazione per la raccolta di dati di durata altamente precisi e accurati, che si ottiene attraverso lo sviluppo di attenti protocolli di calibrazione delle apparecchiature combinati con un’ampia suite software che consente agli utenti di convalidare, correggere e perfezionare le analisi automatizzate¹³. Sebbene il software possa, in linea di principio, essere applicato a diverse modalità di imaging, in pratica, la maggior parte degli utenti utilizza scanner piani modificati per consentire un controllo preciso della temperatura e dell’umidità ambientale, fattori di fondamentale importanza a causa del loro effetto principale sulla durata della vita¹⁹. L’LSM acquisisce immagini dei nematodi ogni 20 minuti a intervalli che vanno da giorni a mesi, a seconda delle condizioni ambientali e del genotipo. I dati prodotti hanno una risoluzione temporale molto più elevata rispetto ai dati dei saggi manuali e le immagini raccolte forniscono una registrazione visiva permanente della posizione del nematode per tutta la durata della vita. Utilizzando metodi di apprendimento automatico, i tempi di morte vengono assegnati automaticamente a ciascun individuo. Questi risultati possono essere convalidati rapidamente e manualmente utilizzando un software client chiamato “Worm Browser”. Grazie al suo hardware e software, l’LSM è in grado di generare curve di sopravvivenza statisticamente indistinguibili dal punteggio manuale dei decessi per mano di ricercatori esperti, con l’ulteriore vantaggio di ridurre il carico di lavoro e aumentare la scalabilit๳.

L’ultima versione dell’LSM consente anche lo studio dell’invecchiamento comportamentale raccogliendo dati morfologici e comportamentali durante tutta la vita del nematode e riportandoli insieme alla durata della vita di ciascun individuo. In particolare, l’LSM cattura il tempo di cessazione del movimento vigoroso (VMC) di ciascun animale, un punto di riferimento spesso utilizzato per quantificare la “durata della salute” di un individuo come distinto dalla sua durata di vita. Raccogliendo simultaneamente dati sulla durata della vita e sull’invecchiamento comportamentale, l’LSM supporta lo studio degli interventi che possono avere effetti differenziali su diversi esiti fenotipici dell’invecchiamento²⁰. Una varietà di fenotipi osservabili macroscopicamente può essere utilizzata per studiare l’invecchiamento comportamentale, come il movimento del corpo o il pompaggio faringeo²¹, l’integrità dei tessuti²² e la velocità di movimento o la rotazione indotta da stimoli¹⁷. I confronti tra diversi fenotipi di invecchiamento possono supportare l’analisi della struttura causale dei processi di invecchiamento. Ad esempio, il confronto tra VMC e durata della vita è stato recentemente utilizzato per caratterizzare due distinti processi di invecchiamento in C. elegans²³.

Sebbene inizialmente sviluppato per misurare la durata della vita in C. elegans, l’LSM supporta la raccolta di dati comportamentali e di sopravvivenza da una serie di specie di nematodi, tra cui C. briggsae, C. tropicalis, C. japonica, C. brenneri, e P. Pacifico²³. La tecnologia facilita lo studio dell’effetto degli interventi biologici e ambientali sulla durata della vita, sulla resistenza allo stress e sulla resistenza ai patogeni e può essere accoppiata a strumenti sperimentali come saggi mirati di interferenza dell’RNA o sistemi di degradazione delle proteine inducibili dall’auxina. Ad oggi, è stato utilizzato nella letteratura scientifica per una vasta gamma di applicazioni 6,24,25,26,27,28,29,30.

Qui, delineiamo un protocollo passo-passo per l’esecuzione di un esperimento Lifespan Machine utilizzando piastre di agar, dalle fasi iniziali della configurazione sperimentale all’output delle curve di sopravvivenza risultanti. Una caratteristica distintiva dell’LSM è che lo sforzo è altamente front-loaded, il che significa che la maggior parte del tempo del ricercatore viene speso durante la configurazione sperimentale e, in piccola misura, durante l’acquisizione post-immagine. La raccolta dei dati è completamente automatizzata per tutta la durata dell’esperimento e permette al ricercatore di avere un’esperienza “a mani libere”. I passaggi qui descritti sono condivisi da molti tipi diversi di saggi di sopravvivenza: la stessa configurazione sperimentale viene eseguita per i saggi di durata della vita, termotolleranza, stress ossidativo e patogenesi. Nella sezione dei risultati rappresentativi, discutiamo un sottoinsieme di dati da un manoscritto pubblicato di recente per illustrare l’efficacia della pipeline di analisi ed evidenziare i passaggi più importanti durante l’analisi delle immagini²³.

Protocol

1. Requisiti software e hardware Scanner piani: in linea di principio, l’LSM può essere implementato utilizzando una varietà di dispositivi di imaging. Istruzioni dettagliate per le modifiche e la messa a fuoco dello scanner sono disponibili altrove13. L’hardware LSM è mostrato nella Figura 1 supplementare. Strumenti di analisi dei dati: il software LSM ha tre componenti interagenti: un pacchetto software di controllo dello scanner basato su…

Representative Results

La riproducibilità sperimentale nei saggi di durata della vita è impegnativa e richiede sia condizioni sperimentali strettamente controllate che grandi popolazioni per ottenere una risoluzione statistica sufficiente 4,36. L’LSM è particolarmente adatto per il rilevamento di grandi popolazioni di animali in un ambiente costante con un’elevata risoluzione temporale. Per dimostrare la capacità dell’LSM, evidenziare le fasi cruciali dell’analisi e aiutare i ricer…

Discussion

Qui forniamo un protocollo dettagliato e accessibile per l’esecuzione di un esperimento utilizzando l’ultima versione di Lifespan Machine. Abbiamo dimostrato che il passaggio critico per ottenere curve di sopravvivenza ben risolte è l’esclusione manuale di oggetti non vermi durante l’acquisizione post-immagine. L’annotazione manuale del tempo di morte ha un piccolo effetto sulla forma complessiva delle curve di sopravvivenza, dimostrando che la stima del tempo di morte completamente automatizzata è efficiente anche sen…

Materials

1-Naphtaleneacetic  acid (Auxin)	Sigma	N0640	Solubilize Auxin in 1M potassium hydroxide and add into molten agar
5-fluoro-2-deoxyuridine (FUDR)	Sigma	F0503	27.5 μg/mL of FUDR was used to eliminate progeny from populations on UV-inactivated bacteria
Glass cleaner	Kristal-M	QB-KRISTAL-M125ml
Hydrophobic anti-fog glass treatment	Rain-X Scheibenreiniger	C. 059140
Rubber matt	Local crafstman		Cut on a high-strength EPDM rubber sheet stock
Scanner glass	Local hardware supplier		9" x 11.5" inch glass sheet
Scanner plates	Life Sciences	351006	50 mm x 9 mm, polystyrene petri dish
USB Reference Thermometer	USB Brando	ULIFE055500	For calibrating temperature of scanners