Ensayos de envejecimiento conductual y vida útil de alto rendimiento con la máquina Lifespan

Summary

La plataforma de imágenes “The Lifespan Machine” automatiza la observación de por vida de grandes poblaciones. Mostramos los pasos necesarios para realizar ensayos de esperanza de vida, resistencia al estrés, patogénesis y envejecimiento conductual. La calidad y el alcance de los datos permiten a los investigadores estudiar las intervenciones en el envejecimiento a pesar de la presencia de variaciones biológicas y ambientales.

Abstract

Los animales genéticamente idénticos mantenidos en un ambiente constante muestran una amplia distribución de la esperanza de vida, lo que refleja un gran aspecto estocástico no genético del envejecimiento conservado en todos los organismos estudiados. Este componente estocástico significa que para comprender el envejecimiento e identificar intervenciones exitosas que extiendan la vida útil o mejoren la salud, los investigadores deben monitorear grandes poblaciones de animales de experimentación simultáneamente. La puntuación manual tradicional de muertes limita el rendimiento y la escala necesarios para las pruebas de hipótesis a gran escala, lo que lleva al desarrollo de métodos automatizados para ensayos de vida útil de alto rendimiento. Lifespan Machine (LSM) es una plataforma de procesamiento de imágenes de alto rendimiento que combina escáneres planos modificados con software personalizado de procesamiento de imágenes y validación de datos para el seguimiento de nematodos durante toda la vida. La plataforma constituye un gran avance técnico al generar datos de vida útil altamente resueltos temporalmente de grandes poblaciones de animales a una escala sin precedentes y con una precisión estadística y exactitud igual a los ensayos manuales realizados por investigadores experimentados. Recientemente, el LSM se ha desarrollado aún más para cuantificar los cambios conductuales y morfológicos observados durante el envejecimiento y relacionarlos con la esperanza de vida. A continuación, describimos cómo planificar, ejecutar y analizar un experimento automatizado de vida útil mediante el LSM. Además, destacamos los pasos críticos necesarios para la recopilación exitosa de datos de comportamiento y curvas de supervivencia de alta calidad.

Introduction

El envejecimiento es un proceso complejo y multifacético caracterizado por una disminución de la función fisiológica de un organismo, lo que conduce a un aumento del riesgo de enfermedad y muerte a lo largo del tiempo¹. La esperanza de vida, medida como el tiempo que transcurre desde el nacimiento o el inicio de la edad adulta hasta la muerte, proporciona un resultado inequívoco del envejecimiento² y un indicador indirecto pero rigurosamente cuantitativo para medir la tasa relativa de envejecimiento entre poblaciones³. Los estudios sobre el envejecimiento a menudo dependen de mediciones precisas de la esperanza de vida, similares a los ensayos clínicos, para comparar los resultados entre una población expuesta a una intervención y un grupo de control no expuesto. Desafortunadamente, los problemas de reproducibilidad impregnan la investigación sobre el envejecimiento, a veces debido a experimentos estadísticamente poco potentes⁴ y, a menudo, debido a la sensibilidad inherente de los ensayos de vida útil a las variaciones sutiles en el medio ambiente⁵. Los experimentos robustos requieren múltiples réplicas de grandes poblaciones, y este proceso se beneficia particularmente de la escalabilidad experimental que ofrece la automatización⁶.

Las rigurosas exigencias de los ensayos de vida útil se originan en la imprevisibilidad del propio proceso de envejecimiento. Los individuos isogénicos alojados en ambientes idénticos muestran diferentes tiempos de muerte y tasas de deterioro fisiológico⁷, lo que sugiere que la esperanza de vida implica un alto grado de estocasticidad ^7,8. Por lo tanto, se requiere que las grandes poblaciones midan los cambios cuantitativos en el proceso de envejecimiento, como los cambios en la esperanza de vida media o máxima, y que superen los sesgos derivados de la variabilidad individual. Además, la capacidad de realizar ensayos de vida útil de alto rendimiento es crucial para respaldar los estudios de las formas de las curvas de supervivencia y los modelos de la dinámica del envejecimiento⁹.

El nematodo Caenorhabditis elegans es un modelo invaluable para la investigación del envejecimiento debido a su corta vida útil, trazabilidad genética y rápido tiempo de generación, lo que subraya su idoneidad para ensayos de envejecimiento y vida útil de alto rendimiento. Tradicionalmente, la esperanza de vida en C. El elegans se ha medido siguiendo una pequeña población sincronizada de unos 50-100 animales a lo largo del tiempo en medios sólidos y anotando el tiempo de las muertes individuales. A medida que los animales envejecen y pierden movilidad, la puntuación manual de los tiempos de muerte requiere pinchar individualmente a los animales y comprobar si hay pequeños movimientos de la cabeza o la cola. Este suele ser un proceso tedioso y laborioso, aunque se han hecho esfuerzos para acelerarlo 10,11,12. Es importante destacar que la lentitud de los procesos experimentales dificulta el progreso en nuestra comprensión del envejecimiento y la eficacia de las intervenciones probadas.

Para satisfacer las demandas de datos cuantitativos de la investigación sobre el envejecimiento, se han desarrollado muchas tecnologías para automatizar la recopilación de datos, incluida una notable gama de enfoques, desde cámaras microfluídicas hasta escáneres planos 13,14,15,16,17,18. El LSM se diferencia de otros métodos en su amplia optimización para la recopilación de datos de vida útil altamente precisos y exactos, lo que se logra mediante el desarrollo de protocolos de calibración de equipos cuidadosos combinados con un amplio paquete de software que permite a los usuarios validar, corregir y refinar los análisis automatizados¹³. Aunque el software puede, en principio, aplicarse a diversas modalidades de obtención de imágenes, en la práctica, la mayoría de los usuarios utilizan escáneres planos modificados para permitir un control preciso de la temperatura y la humedad ambientales, factores de importancia crítica debido a su importante efecto en la vida útil¹⁹. El LSM toma imágenes de nematodos cada 20 minutos en intervalos que van desde días hasta meses, dependiendo de las condiciones ambientales y el genotipo. Los datos producidos tienen una resolución temporal mucho mayor en comparación con los datos de los ensayos manuales, y las imágenes recopiladas proporcionan un registro visual permanente de la posición del nematodo a lo largo de la vida. Utilizando métodos de aprendizaje automático, los tiempos de muerte se asignan automáticamente a cada individuo. Estos resultados se pueden validar rápida y manualmente utilizando un software cliente llamado “Worm Browser”. Como resultado de su hardware y software, el LSM puede generar curvas de supervivencia que son estadísticamente indistinguibles de la puntuación manual de muertes a manos de investigadores experimentados, con la ventaja añadida de una menor carga de trabajo y una mayor escalabilidad¹³.

La última versión del LSM también permite el estudio del envejecimiento conductual mediante la recopilación de datos morfológicos y conductuales a lo largo de la vida del nematodo y su informe junto con la vida útil de cada individuo. En particular, el LSM captura el tiempo de cese de movimiento vigoroso (VMC) de cada animal, un punto de referencia que a menudo se usa para cuantificar la “duración de la salud” de un individuo a diferencia de su esperanza de vida. Al recopilar simultáneamente datos sobre la esperanza de vida y el envejecimiento conductual, el LSM apoya el estudio de intervenciones que pueden tener efectos diferenciales en diferentes resultados fenotípicos del envejecimiento²⁰. Se puede utilizar una variedad de fenotipos macroscópicamente observables para estudiar el envejecimiento conductual, como el movimiento corporal o el bombeo faríngeo²¹, la integridad de los tejidos²² y la velocidad de movimiento o el giro inducido por estímulos¹⁷. Las comparaciones entre diferentes fenotipos de envejecimiento pueden apoyar el análisis de la estructura causal de los procesos de envejecimiento. Por ejemplo, la comparación entre VMC y la esperanza de vida se utilizó recientemente para caracterizar dos procesos de envejecimiento distintos en C. elegans²³.

Si bien se desarrolló inicialmente para medir la esperanza de vida en C. elegans, el LSM apoya la recopilación de datos de supervivencia y comportamiento de una variedad de especies de nematodos, incluido C. briggsae, C. tropicalis, C. japonica, C. brenneri, y P. Pacífico²³. La tecnología facilita el estudio del efecto de las intervenciones biológicas y ambientales en la esperanza de vida, la resistencia al estrés y la resistencia a patógenos, y puede acoplarse a herramientas experimentales como ensayos dirigidos de ARN de interferencia o sistemas de degradación de proteínas inducibles por auxinas. Hasta la fecha, se ha utilizado en la literatura científica para una amplia gama de aplicaciones 6,24,25,26,27,28,29,30.

Aquí, describimos un protocolo paso a paso para realizar un experimento de Lifespan Machine utilizando placas de agar, desde las etapas iniciales de la configuración experimental hasta la salida de las curvas de supervivencia resultantes. Una característica distintiva del LSM es que el esfuerzo se concentra en gran medida en la parte inicial, lo que significa que la mayor parte del tiempo del investigador se dedica a la configuración experimental y, en menor medida, durante la adquisición posterior a la imagen. La recopilación de datos está completamente automatizada durante toda la duración del experimento y permite al investigador tener una experiencia de “manos libres”. Los pasos descritos aquí son comunes a muchos tipos diferentes de ensayos de supervivencia: se realiza la misma configuración experimental para los ensayos de esperanza de vida, termotolerancia, estrés oxidativo y patogénesis. En la sección de resultados representativos, discutimos un subconjunto de datos de un manuscrito publicado recientemente para ilustrar la efectividad de la canalización de análisis y resaltar los pasos más importantes durante el análisis de imágenes²³.

Protocol

1. Requisitos de software y hardware Escáneres planos: En principio, el LSM se puede implementar utilizando una variedad de dispositivos de imagen. Las instrucciones detalladas para las modificaciones y el enfoque del escáner están disponibles en otra parte13. El hardware LSM se muestra en la Figura complementaria 1. Herramientas de análisis de datos: el software LSM tiene tres componentes que interactúan: un paquete de software de control…

Representative Results

La reproducibilidad experimental en los ensayos de esperanza de vida es un reto y requiere tanto condiciones experimentales estrictamente controladas como grandes poblaciones para lograr una resolución estadística suficiente 4,36. El LSM es especialmente adecuado para el estudio de grandes poblaciones de animales en un entorno constante con alta resolución temporal. Para demostrar la capacidad del LSM, resaltar los pasos cruciales del análisis y ayudar a los …

Discussion

Aquí, proporcionamos un protocolo detallado y accesible para realizar un experimento utilizando la última versión de Lifespan Machine. Hemos demostrado que el paso crítico para lograr curvas de supervivencia bien resueltas es la exclusión manual de objetos que no sean gusanos durante la adquisición posterior a la imagen. La anotación manual del tiempo de muerte tiene un pequeño efecto en la forma general de las curvas de supervivencia, lo que demuestra que la estimación totalmente automatizada del tiempo de muer…

Materials

1-Naphtaleneacetic  acid (Auxin)	Sigma	N0640	Solubilize Auxin in 1M potassium hydroxide and add into molten agar
5-fluoro-2-deoxyuridine (FUDR)	Sigma	F0503	27.5 μg/mL of FUDR was used to eliminate progeny from populations on UV-inactivated bacteria
Glass cleaner	Kristal-M	QB-KRISTAL-M125ml
Hydrophobic anti-fog glass treatment	Rain-X Scheibenreiniger	C. 059140
Rubber matt	Local crafstman		Cut on a high-strength EPDM rubber sheet stock
Scanner glass	Local hardware supplier		9" x 11.5" inch glass sheet
Scanner plates	Life Sciences	351006	50 mm x 9 mm, polystyrene petri dish
USB Reference Thermometer	USB Brando	ULIFE055500	For calibrating temperature of scanners