Tests comportementaux à haut débit sur le vieillissement et la durée de vie à l’aide de la machine Lifespan

Summary

La plateforme d’imagerie « The Lifespan Machine » automatise l’observation à vie de grandes populations. Nous montrons les étapes nécessaires pour effectuer des tests de durée de vie, de résistance au stress, de pathogenèse et de vieillissement comportemental. La qualité et l’étendue des données permettent aux chercheurs d’étudier les interventions dans le vieillissement malgré la présence de variations biologiques et environnementales.

Abstract

Les animaux génétiquement identiques maintenus dans un environnement constant présentent une large distribution de la durée de vie, reflétant un grand aspect stochastique non génétique du vieillissement conservé dans tous les organismes étudiés. Cette composante stochastique signifie que pour comprendre le vieillissement et identifier les interventions efficaces qui prolongent la durée de vie ou améliorent la santé, les chercheurs doivent surveiller simultanément de grandes populations d’animaux de laboratoire. L’évaluation manuelle traditionnelle de la mort limite le débit et l’échelle requis pour les tests d’hypothèses à grande échelle, ce qui a conduit au développement de méthodes automatisées pour les tests de durée de vie à haut débit. La Lifespan Machine (LSM) est une plate-forme d’imagerie à haut débit qui combine des scanners à plat modifiés avec un logiciel personnalisé de traitement d’images et de validation des données pour le suivi à vie des nématodes. La plateforme constitue une avancée technique majeure en générant des données de durée de vie hautement résolues temporellement à partir de grandes populations d’animaux à une échelle sans précédent et avec une précision statistique et une exactitude égales à des tests manuels effectués par des chercheurs expérimentés. Récemment, le LSM a été développé pour quantifier les changements comportementaux et morphologiques observés au cours du vieillissement et les relier à la durée de vie. Ici, nous décrivons comment planifier, exécuter et analyser une expérience automatisée de durée de vie à l’aide du LSM. Nous soulignons en outre les étapes critiques nécessaires à la collecte réussie de données comportementales et à des courbes de survie de haute qualité.

Introduction

Le vieillissement est un processus complexe et multidimensionnel caractérisé par un déclin de la fonction physiologique d’un organisme, ce qui entraîne une augmentation du risque de maladie et de décès au fil du temps¹. La durée de vie, mesurée comme le temps écoulé entre la naissance ou le début de l’âge adulte jusqu’à la mort, fournit un résultat sans ambiguïté du vieillissement² et une approximation indirecte mais rigoureusement quantitative pour mesurer le taux relatif de vieillissement entre les populations³. Les études sur le vieillissement dépendent souvent de mesures précises de la durée de vie, similaires aux essais cliniques, pour comparer les résultats entre une population exposée à une intervention et un groupe témoin non exposé. Malheureusement, les problèmes de reproductibilité imprègnent la recherche sur le vieillissement, parfois en raison d’expériences statistiquement sous-alimentées⁴ et souvent en raison de la sensibilité inhérente des tests de durée de vie aux variations subtiles de l’environnement⁵. Les expériences robustes nécessitent de multiples répétitions de grandes populations, et ce processus bénéficie particulièrement de l’évolutivité expérimentale offerte par l’automatisation⁶.

Les exigences rigoureuses des tests de durée de vie proviennent de l’imprévisibilité du processus de vieillissement lui-même. Les individus isogéniques hébergés dans des environnements identiques présentent des temps de mortalité et des taux de déclin physiologique différents⁷, ce qui suggère que la durée de vie implique un degré élevé de stochasticité ^7,8. Par conséquent, de grandes populations sont nécessaires pour mesurer les changements quantitatifs dans le processus de vieillissement, tels que les changements dans la durée de vie moyenne ou maximale, et pour surmonter les biais découlant de la variabilité individuelle. De plus, une capacité de dosage de la durée de vie à haut débit est cruciale pour soutenir les études des formes des courbes de survie et des modèles de la dynamique du vieillissement⁹.

Le nématode Caenorhabditis elegans est un modèle inestimable pour la recherche sur le vieillissement en raison de sa courte durée de vie, de sa tractabilité génétique et de sa durée de génération rapide, ce qui souligne sa pertinence pour les essais de vieillissement et de durée de vie à haut débit. Traditionnellement, la durée de vie en C. elegans a été mesuré en suivant une petite population synchronisée d’environ 50 à 100 animaux au fil du temps sur des supports solides et en notant l’heure des décès individuels. Au fur et à mesure que les animaux vieillissent et perdent de leur mobilité, le marquage manuel des heures de mort nécessite de pousser individuellement les animaux et de vérifier les petits mouvements de la tête ou de la queue. Il s’agit généralement d’un processus fastidieux et laborieux, bien que des efforts aient été faits pour l’accélérer 10,11,12. Il est important de noter que la lenteur des pipelines expérimentaux entrave les progrès dans notre compréhension du vieillissement et de l’efficacité des interventions testées.

Pour répondre aux exigences de la recherche sur le vieillissement en matière de données quantitatives, de nombreuses technologies ont été développées pour automatiser la collecte de données, y compris une gamme remarquable d’approches allant des chambres microfluidiques aux scanners à plat 13,14,15,16,17,18. Le LSM se distingue des autres méthodes par son optimisation poussée pour la collecte de données de durée de vie très précises et exactes, qui est obtenue grâce au développement de protocoles d’étalonnage minutieux des équipements combinés à une suite logicielle complète qui permet aux utilisateurs de valider, de corriger et d’affiner les analyses automatisées¹³. Bien que le logiciel puisse, en principe, être appliqué à diverses modalités d’imagerie, dans la pratique, la plupart des utilisateurs utilisent des scanners à plat modifiés pour permettre un contrôle précis de la température et de l’humidité ambiantes – des facteurs d’une importance critique en raison de leur effet majeur sur la durée de vie¹⁹. Le LSM prend des images de nématodes toutes les 20 minutes à des intervalles allant de quelques jours à plusieurs mois, selon les conditions environnementales et le génotype. Les données produites ont une résolution temporelle beaucoup plus élevée que les données des tests manuels, et les images recueillies fournissent un enregistrement visuel permanent de la position du nématode tout au long de sa vie. À l’aide de méthodes d’apprentissage automatique, les heures de décès sont automatiquement attribuées à chaque individu. Ces résultats peuvent être rapidement et manuellement validés à l’aide d’un logiciel client appelé « Worm Browser ». Grâce à son matériel et à ses logiciels, le LSM peut générer des courbes de survie qui sont statistiquement impossibles à distinguer de l’évaluation manuelle des décès par des chercheurs expérimentés, avec l’avantage supplémentaire d’une charge de travail réduite et d’une plus grande évolutivité¹³.

La dernière version du LSM permet également d’étudier le vieillissement comportemental en collectant des données morphologiques et comportementales tout au long de la vie du nématode et en les rapportant avec la durée de vie de chaque individu. En particulier, le LSM capture le temps de l’arrêt vigoureux des mouvements (VMC) de chaque animal, un point de repère souvent utilisé pour quantifier la « durée de vie » d’un individu par opposition à sa durée de vie. En recueillant simultanément des données sur la durée de vie et le vieillissement comportemental, le LSM soutient l’étude des interventions qui peuvent avoir des effets différentiels sur différents résultats phénotypiques du vieillissement²⁰. Une variété de phénotypes macroscopiquement observables peuvent être utilisés pour étudier le vieillissement comportemental, tels que le mouvement du corps ou le pompage pharyngé²¹, l’intégrité des tissus²² et la vitesse de mouvement ou la rotation induite par le stimulus¹⁷. Les comparaisons entre différents phénotypes de vieillissement peuvent étayer les analyses de la structure causale des processus de vieillissement. Par exemple, la comparaison entre la VMC et la durée de vie a récemment été utilisée pour caractériser deux processus de vieillissement distincts chez C. elegans²³.

Bien qu’il ait été initialement développé pour mesurer la durée de vie de C. elegans, le LSM soutient la collecte de données sur la survie et le comportement d’une gamme d’espèces de nématodes, y compris C. briggsae, C. tropicalis, C. japonica, C. brenneri, et P. pacificus²³. La technologie facilite l’étude de l’effet des interventions biologiques et environnementales sur la durée de vie, la résistance au stress et la résistance aux agents pathogènes et peut être couplée à des outils expérimentaux tels que des tests ciblés d’interférence de l’ARN ou des systèmes de dégradation des protéines inductibles par l’auxine. À ce jour, il a été utilisé dans la littérature scientifique pour un large éventail d’applications 6,24,25,26,27,28,29,30.

Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour la réalisation d’une expérience Lifespan Machine à l’aide de plaques de gélose, depuis les étapes initiales de la configuration expérimentale jusqu’à la sortie des courbes de survie résultantes. L’une des caractéristiques distinctives du LSM est que l’effort est fortement sollicité en amont, ce qui signifie que la majorité du temps du chercheur est consacrée à la mise en place de l’expérience et, dans une moindre mesure, à l’acquisition post-image. La collecte des données est entièrement automatisée pendant toute la durée de l’expérience et permet au chercheur d’avoir une expérience « mains libres ». Les étapes décrites ici sont communes à de nombreux types de tests de survie – la même configuration expérimentale est effectuée pour les tests de durée de vie, de thermotolérance, de stress oxydatif et de pathogenèse. Dans la section des résultats représentatifs, nous discutons d’un sous-ensemble de données tirées d’un manuscrit récemment publié afin d’illustrer l’efficacité du pipeline d’analyse et de mettre en évidence les étapes les plus importantes de l’analyse d’images²³.

Protocol

1. Configuration logicielle et matérielle requise Scanners à plat : En principe, le LSM peut être mis en œuvre à l’aide d’une variété d’appareils d’imagerie. Des instructions détaillées pour les modifications du scanner et la mise au point sont disponibles ailleurs13. Le matériel LSM est illustré à la figure supplémentaire 1. Outils d’analyse de données : le logiciel LSM comporte trois composants interactifs : un progici…

Representative Results

La reproductibilité expérimentale des essais de durée de vie est difficile et nécessite à la fois des conditions expérimentales étroitement contrôlées et de grandes populations pour atteindre une résolution statistique suffisante 4,36. Le LSM est particulièrement adapté à l’étude de grandes populations d’animaux dans un environnement constant avec une résolution temporelle élevée. Afin de démontrer la capacité du LSM, de mettre en évidence…

Discussion

Ici, nous fournissons un protocole détaillé et accessible pour effectuer une expérience à l’aide de la dernière version de la Lifespan Machine. Nous avons montré que l’étape critique pour obtenir des courbes de survie bien résolues est l’exclusion manuelle des objets non-vermifuges lors de l’acquisition post-image. L’annotation manuelle de l’heure de décès a un faible effet sur la forme globale des courbes de survie, ce qui démontre que l’estimation entièrement automatisée de l’heure de déc?…

Materials

1-Naphtaleneacetic  acid (Auxin)	Sigma	N0640	Solubilize Auxin in 1M potassium hydroxide and add into molten agar
5-fluoro-2-deoxyuridine (FUDR)	Sigma	F0503	27.5 μg/mL of FUDR was used to eliminate progeny from populations on UV-inactivated bacteria
Glass cleaner	Kristal-M	QB-KRISTAL-M125ml
Hydrophobic anti-fog glass treatment	Rain-X Scheibenreiniger	C. 059140
Rubber matt	Local crafstman		Cut on a high-strength EPDM rubber sheet stock
Scanner glass	Local hardware supplier		9" x 11.5" inch glass sheet
Scanner plates	Life Sciences	351006	50 mm x 9 mm, polystyrene petri dish
USB Reference Thermometer	USB Brando	ULIFE055500	For calibrating temperature of scanners