Criblage de médicaments cellulaires pour les inhibiteurs de la cystéine 4B peptidase liée à l’autophagie

Résumé

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’utilisation d’un test rapporteur à base de luciférase dans un format de criblage semi-automatisé à haut débit.

Résumé

De plus en plus de preuves ont montré qu’un flux autophagique élevé est lié à la progression tumorale et à la résistance au traitement anticancéreux. Le dosage des protéines d’autophagie individuelles est une condition préalable aux stratégies thérapeutiques ciblant cette voie. Il a été démontré que l’inhibition de la protéase de l’autophagie ATG4B augmente la survie globale, ce qui suggère que l’ATG4B pourrait être une cible médicamenteuse potentielle pour le traitement du cancer. Notre laboratoire a mis au point un test sélectif à base de luciférase pour le suivi de l’activité de l’ATG4B dans les cellules. Pour ce test, le substrat d’ATG4B, LC3B, est marqué à l’extrémité C avec une luciférase sécrétée du copépode marin Gaussia princeps (GLUC). Ce rapporteur est lié au cytosquelette d’actine, le maintenant ainsi dans le cytoplasme des cellules lorsqu’il n’est pas clivé. Le clivage médié par l’ATG4B entraîne la libération de GLUC par sécrétion non conventionnelle, qui peut ensuite être surveillée en récoltant des surnageants de culture cellulaire en tant que corrélat de l’activité cellulaire de l’ATG4B. Cet article présente l’adaptation de ce test à base de luciférase au criblage automatisé à haut débit. Nous décrivons le flux de travail et l’optimisation pour une analyse exemplaire à haut débit de l’activité cellulaire ATG4B.

Introduction

L’autophagie est un processus métabolique conservé qui permet aux cellules de maintenir l’homéostasie intracellulaire et de répondre au stress en dégradant le contenu cellulaire vieilli, défectueux ou inutile via les lysosomes ^1,2,3. Dans certaines conditions physiopathologiques, ce processus agit comme une réponse cellulaire cruciale à la privation de nutriments et d’oxygène, ce qui se traduit par le recyclage des nutriments et des lipides, permettant aux cellules de s’adapter à leurs besoins métaboliques

Protocole

REMARQUE : Le processus d’analyse est décrit à la figure 1. Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et équipements utilisés dans ce protocole.

1. Production de rétrovirus

NOTE : Le plasmide codant pour l’ActinLC3dNGLUC est pMOWS-ActinLC3dNGLUC²⁰. Utilisez un nombre de cellules à faible passage pour la production de virus à titre élevé (idéalement inférieur à P20).

1. Cultiver des cellules HEK293T dans le milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco, complété par 10 % de ....

Résultats

Dans une publication précédente⁸, nous avons utilisé avec succès ce test pour cribler de petites molécules et des banques de siRNA et identifié de nouveaux régulateurs de l’ATG4B. Nous décrivons ici le protocole et les résultats représentatifs de ce rapporteur de luciférase dans un format de criblage semi-automatisé à haut débit. La figure 8 montre un exemple d’analyse des données brutes pour les noyaux cellulaires et la luminescence. Un résultat typique d’une mesure .......

Discussion

Ce protocole décrit un test de gène rapporteur basé sur des cellules pour l’identification d’inhibiteurs de l’ATG4B. L’identification des hits primaires est basée sur l’activité de la luciférase lors du traitement des cellules exprimant le cadre de lecture ouvert sur toute la longueur de la LC3B entre la β-actine et le dNGLUC. Certains avantages de ce test sont qu’il est sensible, hautement quantitatif et non invasif, car il peut détecter le dNGLUC sans lyser les cellules. Cet article présente un protocole détaillé pour .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
50 et micro ; L Embouts jetables - Non filtré, Pur, Imbriqué 8 Stack (Passive Stack)	Tecan	30038609	Disposable 96-tip
BioTek MultiFlo	BioTek		Distributeur en vrac
Coelenterazine	Santa Cruz Biotechnology	sc-205904	substrat
Columbus Logiciel d’analyse d’images	Perkin Elmer	Version 2.9.1	Logiciel d’analyse d’images
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Microplaque en polypropylène 384 puits qualifiée Echo, transparente, non stérile	Beckman Coulter	001-14555	Plaque 384PP
EnVision II	Perkin Elmer		lecteur de plaque
de luminescence Express pick Bibliothèque (96-well)-L3600-Z369949-100µ ; L	Selleckchem	L3600	Selleckchem
FMK9A	MedChemExpress	HY-100522
Greiner FLUOTRAC 200 384 plaques à 384 puits	Greiner Bio-One	781076	solide-noir Plaques à 384 puits
Harmony Logiciel d’imagerie	Perkin Elmer	Version 5.1	Logiciel d’imagerie
Hoechst 33342, Trichlorhydrate, Trihydrate - 10 mg/mL Solution dans l’eau	ThermoFisher	H3570	Hoechst 33342
Labcyte Echo 550 series avec logiciel Echo Cherry Pick	Labcyte/Beckman Coulter		Distributeur de liquide acoustique à l’échelle nanométrique Eau
déminéralisée	l’eau
Opera Phenix Système de dépistage à haut contenu Microscope	automatisé	Perkin Elmer
Solution de paraformaldéhyde 4 % dans PBS	Santa Cruz Biotechnologie	sc-281692
PhenoPlate 384-well, noir, optiquement clair, fond plat, traité par culture tissulaire, couvercles	Perkin Elmer	6057300	CellCarrier-384 Ultra PN
pMOWS-ActinLC3dNGLUC			Obtenu du Dr Robin Ketteler (Département de médecine humaine, Faculté de médecine de Berlin)Réactif d’infection
/transfection en polybrène	Merck	TR-1003-G
Dichlorhydrate de puromycine, 98 %, Thermo Scientific Chemicals	ThermoFisher	J61278.ME	Puromycin
Tecan Freedom EVO 200 robot	Tecan		plateforme robotique de manipulation de liquide
X-tremeGENE HP DNA Réactif de transfection d’ADN Roche		Merck 6366244001	transfection d’ADN

rack à Milli-Q réactif de