Triagem de Drogas Baseadas em Células para Inibidores da Autofagia 4B Cisteína Peptidase Relacionada
Summary
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para o uso de um ensaio de repórter baseado em luciferase em um formato de triagem semi-automatizado e de alto rendimento.
Abstract
Evidências crescentes têm mostrado que o alto fluxo autofágico está relacionado à progressão tumoral e à resistência à terapia do câncer. A dosagem de proteínas individuais de autofagia é um pré-requisito para estratégias terapêuticas direcionadas a essa via. Demonstrou-se que a inibição da protease autofágica ATG4B aumenta a sobrevida global, sugerindo que a ATG4B pode ser um potencial alvo de drogas para a terapia do câncer. Nosso laboratório desenvolveu um ensaio seletivo baseado em luciferase para monitorar a atividade de ATG4B em células. Para este ensaio, o substrato de ATG4B, LC3B, é marcado no término C com uma luciferase secretável do copépode marinho Gaussia princeps (GLUC). Este repórter está ligado ao citoesqueleto da actina, mantendo-o assim no citoplasma das células quando tido. A clivagem mediada por ATG4B resulta na liberação de GLUC por secreção não convencional, que pode ser monitorada pela coleta de sobrenadantes de cultura celular como um correlato da atividade celular de ATG4B. Este artigo apresenta a adaptação deste ensaio baseado em luciferase para triagem automatizada de alto rendimento. Descrevemos o fluxo de trabalho e a otimização para uma análise exemplar de alto rendimento da atividade ATG4B celular.
Introduction
A autofagia é um processo metabólico conservado que permite às células manter a homeostase intracelular e responder ao estresse degradando conteúdos celulares envelhecidos, defeituosos ou desnecessários através dos lisossomos 1,2,3. Em algumas condições fisiopatológicas, esse processo atua como uma resposta celular crucial à privação de nutrientes e oxigênio, resultando em nutrientes e lipídios reciclados, permitindo que as células se adaptem às suas necessidades metabólicas 2,3,4. A autofagia também tem sido identificada como uma resposta celular ao estresse relacionada a diversas doenças, como doenças neurodegenerativas, infecção por patógenos e vários tipos de câncer. A função da autofagia no câncer é complexa e dependente do tipo, estágio e status do tumor. Pode suprimir a tumorigênese por degradação autofágica das células lesadas, mas também pode promover a sobrevivência de tumores avançados por melhorar a sobrevivência celular durante condições estressantes, como hipóxia, privação de nutrientes e dano citotóxico2,4,5,6.
Vários estudos têm demonstrado que a inibição da autofagia proporciona um benefício como estratégia antineoplásica. Assim, a inibição de etapas críticas, como a formação do autofagossomo ou sua fusão com o lisossomo, poderia ser um método eficaz para o controle do câncer2,4,5,6. Evidências crescentes têm mostrado que a ATG4B está envolvida em certas condições patológicas, e tem ganhado atenção como um potencial alvo anticâncer2,3,4. Por exemplo, observou-se que células de câncer colorretal e células de câncer de mama positivas para receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2) apresentaram níveis de expressão de ATG4B significativamente mais elevados do que células normais adjacentes 2,4. Em células de câncer de próstata, a inibição da ATG4B resultou em suscetibilidade específica de linhagem celular à quimioterapia e radioterapia7. Recentemente, surgiram fortes evidências de que o adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) é particularmente vulnerável à inibição da ATG4B. Por exemplo, em um modelo de camundongo geneticamente modificado, demonstrou-se que a perda intermitente da função ATG4B reduz o crescimento tumoral de ADP e aumenta a sobrevida 3,4. Em geral, a ATG4B é altamente superexpressa em alguns tipos de câncer, está relacionada à progressão do tumor e está ligada à resistência à terapia do câncer 2,4,8.
As ATG4 cisteína proteases em mamíferos possuem quatro membros da família, ATG4A-ATG4D. Essas proteínas exibem alguma seletividade alvo para a família de proteínas LC3/GABARAP (ATG8) 9,10,11 e podem ter funções adicionais não ligadas à sua atividade proteásica12,13. Além disso, a ATG4 atua na regulação de um novo tipo de modificação pós-traducional, a ATG8-ilação de proteínas11,12. Embora a ATG4B e seu principal substrato LC3B sejam os mais estudados, um quadro está emergindo que sugere um papel complexo para cada membro da subfamília na regulação de processos autofágicos e não autofágicos. Isso é corroborado por uma complexa rede de modificações pós-traducionais que regulam a atividade da ATG4B via fosforilação, acetilação, glicosilação e nitrosilação 9,10,11,12,13.
Vários inibidores conhecidos de ATG4B foram publicados2,4,14,15. Embora sejam adequados como ferramentas de pesquisa, seu perfil farmacodinâmico, seletividade ou potência ainda os impedem de se desenvolver como candidatos pré-clínicos 4,16. Em geral, há uma necessidade urgente de identificar compostos mais potentes e seletivos. Muitas vezes, os compostos são bons inibidores bioquímicos da função proteica, mas sua eficácia em ensaios baseados em células é pobre. Existem vários ensaios para monitorar a atividade de ATG4B, incluindo métodos bioquímicos e ensaios baseados em células4. Desenvolvemos previamente um ensaio simples, baseado em luminescência e de alto rendimento para monitorar a atividade de ATG4B em células 8,17. Este ensaio utiliza uma proteína luciferase de Gaussia princeps (GLUC) que é estável e ativa no meio extracelular e pode ser liberada inducivelmente das células em resposta à atividade proteolítica ATG4B18,19.
Nesta construção do repórter, a dNGLUC está ligada ao citoesqueleto de actina das células. Um ligante protease-específico pode ser introduzido entre a âncora de β-actina e a dNGLUC, tornando a secreção dependente da clivagem do ligante. Utilizou-se o quadro de leitura aberta de comprimento total da CL3B entre β-actina e dNGLUC, para poder monitorar a clivagem da CL3B17,18,19. Embora o mecanismo de secreção da dNGLUC seja pouco compreendido, ele é específico para monitorar a atividade de ATG4B, não depende da autofagia global como ocorre em células knockout de ATG5 e é mediado por mecanismos não convencionais que não requerem um peptídeo sinal clássico 4,18,19. Usamos com sucesso este repórter para selecionar pequenas moléculas e bibliotecas de siRNA, e identificamos novos reguladores da atividade de ATG4B, como as quinases da proteína Akt8. Este artigo descreve um protocolo detalhado para o uso deste repórter de luciferase em um formato de triagem semi-automatizado e de alto rendimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um ensaio genético-repórter baseado em células para a identificação de inibidores de ATG4B. A identificação de hits primários é baseada na atividade da luciferase no tratamento de células que expressam o quadro de leitura aberto de comprimento total da LC3B entre β-actina e dNGLUC. Algumas vantagens deste ensaio são que ele é sensível, altamente quantitativo e não invasivo, pois pode detectar dNGLUC sem lisar as células. Este trabalho apresenta um protocolo detalhado para geração…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento principal do Conselho de Pesquisa Médica do Reino Unido para o MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B, MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (referência de concessão 2018RIF_15), e o esquema de Apoio à Aceleração Terapêutica da UCL, apoiado pelo financiamento do MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. O plasmídeo que codifica o ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) foi obtido do Dr. Robin Ketteler (Departamento de Medicina Humana, Faculdade de Medicina de Berlim).
Materials
| 50 µL Disposable Tips – Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
References
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