Ex Vivo Cultivo de perfusión de grandes vasos sanguíneos en un biorreactor impreso en 3D
Summary
Este protocolo presenta la configuración y el funcionamiento de un biorreactor impreso en 3D recientemente desarrollado para el cultivo ex vivo de vasos sanguíneos en perfusión. El sistema está diseñado para ser fácilmente adoptado por otros usuarios, práctico, asequible y adaptable a diferentes aplicaciones experimentales, como biología básica y estudios farmacológicos.
Abstract
Las enfermedades vasculares constituyen la base de la mayoría de las enfermedades cardiovasculares (ECV), que siguen siendo la principal causa de mortalidad y morbilidad en todo el mundo. Se necesitan urgentemente intervenciones quirúrgicas y farmacológicas eficaces para prevenir y tratar la enfermedad vascular. En parte, la escasez de modelos traslacionales limita la comprensión de los procesos celulares y moleculares implicados en la enfermedad vascular. Los biorreactores de cultivo de perfusión ex vivo proporcionan una plataforma ideal para el estudio de grandes vasos animales (incluidos los seres humanos) en un entorno dinámico controlado, combinando la facilidad del cultivo in vitro y la complejidad del tejido vivo. Sin embargo, la mayoría de los biorreactores se fabrican a medida y, por lo tanto, son difíciles de adoptar, lo que limita la reproducibilidad de los resultados. Este artículo presenta un sistema impreso en 3D que se puede producir y aplicar fácilmente en cualquier laboratorio biológico, y proporciona un protocolo detallado para su configuración, lo que permite la operación de los usuarios. Este innovador y reproducible sistema de cultivo de perfusión ex vivo permite el cultivo de vasos sanguíneos durante un máximo de 7 días en condiciones fisiológicas. Esperamos que la adopción de un biorreactor de perfusión estandarizado apoye una mejor comprensión de los procesos fisiológicos y patológicos en los vasos sanguíneos de animales grandes y acelere el descubrimiento de nuevas terapias.
Introduction
La pared vascular existe en un estado estacionario reactivo, lo que asegura tanto la responsabilidad a los estímulos externos (i.e., cambio de presión, vasoconstrictores) como una superficie consistente no activadora que impide la coagulación de la sangre y la infiltración de células inflamatorias1. En respuesta a estímulos dependientes del envejecimiento y del estilo de vida y ante el daño directo, la pared vascular activa procesos de remodelación como la reestenosis y la aterosclerosis, que se sabe que contribuyen a las enfermedades cardiovasculares (ECV) comunes, como el accidente cerebrovascular isquémico y el infarto de miocardio2. Si bien existen enfoques intervencionistas como la revascularización percutánea y la colocación de stents para abordar las manifestaciones avanzadas de la enfermedad vascular, se sabe que provocan un daño vascular adicional, lo que a menudo conduce a la recurrencia. Además, solo se dispone de soluciones preventivas y de fase inicial limitadas. La comprensión de los mecanismos que mantienen la homeostasis de la pared vascular y conducen a su disfunción es fundamental para el desarrollo de nuevas curas3.
A pesar del constante desarrollo y los avances en biología molecular e ingeniería de tejidos, los estudios con animales siguen siendo un componente crucial de los estudios de biología vascular. Los estudios in vivo en animales han proporcionado una enorme comprensión de los mecanismos de la homeostasis vascular y la patología; Sin embargo, estos procedimientos son costosos, tienen un rendimiento relativamente bajo y plantean problemas éticos sustanciales. Además, los animales pequeños son poco representativos de la fisiología vascular humana, y los experimentos con animales más grandes son mucho más caros y crean más consideraciones éticas 4,5. Con la creciente demanda de soluciones farmacéuticas y médicas para una población que envejece rápidamente, las desventajas del uso de animales se magnifican, lo que afecta la reproducibilidad, confiabilidad y transferibilidad de los resultados a la atención del paciente6.
Los sistemas in vitro ofrecen una plataforma simplificada para estudiar los mecanismos básicos, pero no recapitulan la complejidad de todo el tejido, las interacciones entre las células y la matriz extracelular, y las fuerzas mecánicas, que son determinantes críticos en el desarrollo de enfermedades vasculares7.
Los estudios ex vivo realizados en tejidos enteros mantenidos en entornos controlados artificialmente imitan la complejidad in vivo al tiempo que permiten investigaciones de rendimiento relativamente alto8. Dada la capacidad de controlar de cerca las condiciones de cultivo y el entorno, los modelos ex vivo permiten una amplia gama de estudios complejos y proporcionan una alternativa adecuada para reducir el uso de procedimientos animales en biología vascular. Los cultivos estáticos de anillos vasculares ofrecieron información interesante, pero no incorporaron el elemento hemodinámico crucial9. De hecho, el estudio del sistema vascular ex vivo plantea desafíos específicos relacionados con las muchas fuerzas dinámicas que se aplican a las células dentro de la pared de los vasos sanguíneos. Estímulos como el flujo luminal, la turbulencia, el esfuerzo cortante, la presión y la deformación de la pared impactan significativamente en la fisiopatología tisular10,11,12.
Los biorreactores de perfusión son esenciales para el estudio de la homeostasis y la remodelación vascular en respuesta a lesiones o cambios hemodinámicos13. Además, el cultivo de perfusión se puede utilizar para mejorar la maduración y durabilidad de los vasos sanguíneos de ingeniería tisular (TEBV), proporcionando alternativas adecuadas para los injertos vasculares14.
Los biorreactores de perfusión disponibles en el mercado tienen una flexibilidad y adaptabilidad limitadas y son costosos. En cambio, muchos de los biorreactores desarrollados internamente existentes son difíciles de replicar en otros laboratorios, debido a las descripciones limitadas y la falta de disponibilidad de componentes especialmente fabricados 7,8,9,10,11,12. Para superar estas limitaciones, hemos desarrollado recientemente un nuevo biorreactor (EasyFlow), que es económico de producir, se adapta a una amplia gama de tejidos y permite modificaciones relativamente sencillas para adaptarse a diferentes demandas de investigación13. El inserto está impreso en 3D y encaja como en la tapa de un tubo de centrífuga estándar de 50 ml. Su diseño modular y su fabricación en impresión 3D lo hacen accesible y reproducible en diferentes laboratorios, así como fácilmente modificable para adaptarse a diferentes necesidades científicas. Este protocolo describe el montaje y el funcionamiento básico del sistema de biorreactor en un entorno de perfusión arterial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los sistemas de perfusión vascular ex vivo constituyen una plataforma única para estudiar la función y el comportamiento de las células vasculares dentro de sus tejidos nativos en condiciones controladas, lo que permite la disección de procesos complejos como la remodelación vascular post-lesión22. Sin embargo, la mayoría de los biorreactores de los que se tiene noticia son sistemas de fabricación propia basados en componentes hechos a medida y, a menudo, son difíciles de replic…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Centro de Patología Veterinaria de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Surrey por los servicios de histología. También agradecemos a los Dres. L. Dixon, A. Reis y M. Henstock del Instituto Pirbright (Pirbright, Reino Unido) por su apoyo en la obtención de los tejidos animales, y al Departamento de Ciencias Bioquímicas de la Universidad de Surrey, especialmente al equipo técnico, por su continuo apoyo. RSM fue apoyado por el premio de beca del Colegio de Doctorado (Universidad de Surrey), DM y PC fueron apoyados por el Centro Nacional para el Reemplazo, Refinamiento y Reducción de Animales en Investigación (números de subvención: NC/R001006/1 y NC/T001216/1).
Materials
| EasyFlow | – | – | 3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs |
| PA12 – 3D printing | Protolabs | – | – |
| Peristaltic pump | Heidolph | PD5201 | |
| Culture media components: | |||
| Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water | Sigma-Aldrich | A2942-20ML | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8802-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Immunostaining materials: | |||
| Cryostat | LEICA | CM3050 S | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Goat α-Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Invitrogen eBioscience Fluoromount G | Thermo Fisher Scientific | 50-187-88 | |
| MX35 Premier + Microtome Blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| Optimal Cooling Tempearure Compound – OCT | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Rabbit α-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Sudan Black B | Santa Cruz Biotechnology | SC-203760 | |
| X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90° Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box | Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| α-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor® 647-conjugated antibody | R&D Systems | IC1420R | |
| Material for laser cutting of components: | |||
| Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of washers) | RS Components | 258-6590 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Optional pressure monitors: | |||
| Pressure sensor | Parker Hannifin | 080-699PSX-3P-5 | |
| SciPres Pressure Monitor | Parker Hannifin | 206-200-M | |
| Pre-sterilized single use plasticware: | |||
| 0.2 um filter | Sarstedt | 70.1114.210 | |
| 20 mL Sterile syringe | IMS Euro | 40004 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | Sarstedt – 62.547.254 | |
| Small components: | |||
| Cable ties | – | – | |
| Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb | Cole-Parmer | WZ-30800-10 | Barb Adaptor |
| Masterflex Polycarbonate Luer Fittings | Cole-Parmer | AU-45504-84 | |
| Nylon Miniature Check Valve | Cole-Parmer | 98553-00 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Stainless Steel M2 Hex Nuts | RS Components | 527-218 | |
| Stainless Steel M2 x 6 mm Screws | RS Components | 418-7426 | |
| Stainless Steel M5 Hex Nuts | RS Components | 189-585 | |
| Surgical vessel loop | Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies | 10-1003 | |
| Three-way valves | IMS Euro | 91000 | |
| Surgical Equipment | |||
| Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07 | International Medical Supplies | SKU: BD-07 | |
| Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm | International Medical Supplies | SKU: BD-361 | |
| Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm | International Medical Supplies | SKU: FD-12 | |
| Troge Surgical Scalpels – Size 23 – Box of 100 | International Medical Supplies | 63114 | |
| Tubing: | |||
| Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm) | Eppendorf | M0740-2396 | System tubing |
| Masterflex PharMed BPT 3-Stop Tubing | ISMATEC | 95714-48 | Soft wall tubing (for clamp) |
| RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone | RS Components | 667-8432 | Resistance tubing (small inner diameter) |
| Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm) | Heidolph | 525-30027-00-0 | One way valve tube |
| Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene | RS Components | 125-4042 | Pump Tubing |
References
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