Ex Vivo(エクス・ビボ )3Dプリントされたバイオリアクターでの大血管の灌流培養
Summary
このプロトコルは、灌流中の血管の ex vivo 培養のために、新たに開発された3Dプリントされたバイオリアクターのセットアップと操作を示しています。このシステムは、他のユーザーが簡単に採用できるように設計されており、実用的で手頃な価格で、基礎生物学や薬理学的研究などのさまざまな実験アプリケーションに適応できます。
Abstract
血管疾患は、ほとんどの心血管疾患(CVD)の基礎を形成しており、世界中の死亡率と罹患率の主な原因であり続けています。血管疾患を予防および治療するための効果的な外科的および薬理学的介入が緊急に必要とされています。トランスレーショナルモデルの不足は、血管疾患に関与する細胞および分子プロセスの理解を制限している部分もあります。 Ex vivo 灌流培養バイオリアクターは、 in vitro 培養の容易さと生体組織の複雑さを兼ね備えた、制御された動的環境での大型動物血管(ヒトを含む)の研究に理想的なプラットフォームを提供します。しかし、ほとんどのバイオリアクターはカスタムメイドであるため、採用が難しく、結果の再現性が制限されます。この論文では、あらゆる生物学研究室で簡単に製造および適用できる3Dプリントシステムを紹介し、そのセットアップのための詳細なプロトコルを提供し、ユーザーの操作を可能にします。この革新的で再現性の高いex vivo 灌流培養システムは、生理学的条件で最大7日間の血管培養を可能にします。標準化された灌流バイオリアクターの採用により、大動物の血管における生理学的および病理学的プロセスの理解が深まり、新しい治療法の発見が加速することが期待されます。
Introduction
血管壁は反応性定常状態で存在し、外部刺激(すなわち、圧力の変化、血管収縮剤)に対する応答性と、血液凝固と炎症性細胞浸潤を防ぐ一貫した非活性化表面の両方を保証します1。血管壁は、加齢や生活習慣に依存する刺激や直接的な損傷に反応して、虚血性脳卒中や心筋梗塞などの一般的な心血管疾患(CVD)の一因として知られている再狭窄やアテローム性動脈硬化症などのリモデリングプロセスを活性化します2。血管疾患の進行した症状に対処するために、経皮的血行再建術やステント留置術などの介入的アプローチが利用可能ですが、これらはさらなる血管損傷を引き起こし、しばしば再発につながることが知られています。さらに、限られた予防的および初期段階のソリューションしか利用できません。血管壁の恒常性を維持し、その機能不全を促進するメカニズムを理解することは、新しい治療法の開発の中核です3。
分子生物学と組織工学の絶え間ない発展と進歩にもかかわらず、動物実験は依然として血管生物学研究の重要な要素です。in vivo動物実験は、血管の恒常性と病理学のメカニズムに関する膨大な洞察を提供してきました。しかし、これらの手順はコストがかかり、スループットが比較的低く、重大な倫理的問題を引き起こします。さらに、小動物はヒトの血管生理学をあまり代表しておらず、大規模な動物実験ははるかに費用がかかり、さらなる倫理的配慮が生じます4,5。急速に高齢化が進む人口に対する医薬品および医療ソリューションの需要が高まる中、動物使用のマイナス面が拡大し、結果の再現性、信頼性、および患者ケアへの転用可能性に影響を与えています6。
In vitro システムは、基本的なメカニズムを研究するための簡略化されたプラットフォームを提供しますが、組織全体の複雑さ、細胞と細胞外マトリックスの間の相互作用、および血管疾患の発症における重要な決定要因である機械的力を再現することはできません7。
人工的に制御された環境で維持された組織全体に対して実施されるEx vivo研究は、in vivoの複雑さを模倣しながら、比較的ハイスループットな研究を可能にします8。培養条件と環境を綿密に制御する能力を考えると、ex vivoモデルは幅広い複雑な研究を可能にし、血管生物学における動物実験の使用を減らすための適切な代替手段を提供します。静的血管リング培養は興味深い洞察をもたらしたが、重要な血行動態要素を組み込むことができなかった9。実際、ex vivoの血管系の研究は、血管壁内の細胞に適用される多くの動的力に関連する特定の課題を提起します。管腔流、乱流、せん断応力、圧力、壁の変形などの刺激は、組織の病態生理に大きな影響を与えます10,11,12。
灌流バイオリアクターは、血管の恒常性を研究し、損傷や血行動態の変化に応答してリモデリングするために不可欠です13。さらに、灌流培養は、組織工学的血管(TEBV)の成熟および耐久性を改善するために使用でき、血管移植片14の適切な代替手段を提供する。
市販の灌流バイオリアクターは、柔軟性と適応性に限界があり、コストがかかります。既存の自社開発バイオリアクターの多くは、説明が限られており、特別に作られたコンポーネントが入手できないため、他のラボで再現することは困難です7、8、9、10、11、12。これらの制限を克服するために、私たちは最近、経済的に製造でき、さまざまな組織に対応し、さまざまな研究要求に適応するための比較的簡単な変更を可能にする新しいバイオリアクター(EasyFlow)を開発しました13。インサートは3Dプリントされており、標準的な50 mL遠心チューブの蓋のようにフィットします。そのモジュール設計と3Dプリンティング製造により、さまざまなラボでアクセス可能で再現性があり、さまざまな科学的ニーズに適応するために簡単に変更できます。このプロトコルは、動脈灌流設定におけるバイオリアクターシステムの組み立てと基本的な操作について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex vivo 血管灌流システムは、制御された条件下で天然組織内の血管細胞の機能と挙動を研究するための独自のプラットフォームを構成し、損傷後の血管リモデリングなどの複雑なプロセスの解剖を可能にします22。しかし、報告されているバイオリアクターのほとんどは、カスタムメイドのコンポーネントをベースにした自社製のシステムであり、他の人が複製するこ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、組織学サービスについて、サリー大学獣医学部の獣医病理学センターに感謝したい。また、動物組織の調達に協力してくださったPirbright Institute(英国、ピルブライト)のL. Dixon博士、A. Reis博士、M. Henstock博士、サリー大学生化学科学部、特に技術チームの継続的な支援に感謝します。RSMはDoctoral College studentship award(サリー大学)の支援を受け、DMとPCはNational Centre for the Replacement, Refinement & Reduction of Animals in Research(助成金番号:NC/R001006/1およびNC/T001216/1)の支援を受けました。
Materials
| EasyFlow | – | – | 3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs |
| PA12 – 3D printing | Protolabs | – | – |
| Peristaltic pump | Heidolph | PD5201 | |
| Culture media components: | |||
| Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water | Sigma-Aldrich | A2942-20ML | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8802-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Immunostaining materials: | |||
| Cryostat | LEICA | CM3050 S | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Goat α-Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Invitrogen eBioscience Fluoromount G | Thermo Fisher Scientific | 50-187-88 | |
| MX35 Premier + Microtome Blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| Optimal Cooling Tempearure Compound – OCT | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Rabbit α-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Sudan Black B | Santa Cruz Biotechnology | SC-203760 | |
| X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90° Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box | Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| α-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor® 647-conjugated antibody | R&D Systems | IC1420R | |
| Material for laser cutting of components: | |||
| Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of washers) | RS Components | 258-6590 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Optional pressure monitors: | |||
| Pressure sensor | Parker Hannifin | 080-699PSX-3P-5 | |
| SciPres Pressure Monitor | Parker Hannifin | 206-200-M | |
| Pre-sterilized single use plasticware: | |||
| 0.2 um filter | Sarstedt | 70.1114.210 | |
| 20 mL Sterile syringe | IMS Euro | 40004 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | Sarstedt – 62.547.254 | |
| Small components: | |||
| Cable ties | – | – | |
| Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb | Cole-Parmer | WZ-30800-10 | Barb Adaptor |
| Masterflex Polycarbonate Luer Fittings | Cole-Parmer | AU-45504-84 | |
| Nylon Miniature Check Valve | Cole-Parmer | 98553-00 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Stainless Steel M2 Hex Nuts | RS Components | 527-218 | |
| Stainless Steel M2 x 6 mm Screws | RS Components | 418-7426 | |
| Stainless Steel M5 Hex Nuts | RS Components | 189-585 | |
| Surgical vessel loop | Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies | 10-1003 | |
| Three-way valves | IMS Euro | 91000 | |
| Surgical Equipment | |||
| Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07 | International Medical Supplies | SKU: BD-07 | |
| Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm | International Medical Supplies | SKU: BD-361 | |
| Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm | International Medical Supplies | SKU: FD-12 | |
| Troge Surgical Scalpels – Size 23 – Box of 100 | International Medical Supplies | 63114 | |
| Tubing: | |||
| Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm) | Eppendorf | M0740-2396 | System tubing |
| Masterflex PharMed BPT 3-Stop Tubing | ISMATEC | 95714-48 | Soft wall tubing (for clamp) |
| RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone | RS Components | 667-8432 | Resistance tubing (small inner diameter) |
| Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm) | Heidolph | 525-30027-00-0 | One way valve tube |
| Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene | RS Components | 125-4042 | Pump Tubing |
References
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