Grootschalige celproductie op basis van GMP-kwaliteit oplosbare poreuze microdragers

Summary

Hier presenteren we een protocol om de grootschalige productie van aanhangende cellen te bereiken via een volledig gesloten systeem op basis van GMP-kwaliteit oplosbare microdragers. De kweek van menselijke mesenchymale stamcellen, HEK293T cellen en Vero-cellen werd gevalideerd en voldeed aan zowel de kwantiteitseisen als de kwaliteitscriteria voor de cel- en gentherapie-industrie.

Abstract

Onderzoekers in de cel- en gentherapie-industrie (CGT) staan al lang voor een formidabele uitdaging bij het efficiënt en op grote schaal uitbreiden van cellen. Om de belangrijkste tekortkomingen van het tweedimensionale (2D) vlakke kweeksysteem aan te pakken, hebben we op innovatieve wijze een geautomatiseerd platform voor gesloten celproductie op industriële schaal (ACISCP) ontwikkeld op basis van een GMP-kwaliteit, oplosbare en poreuze microdrager voor de 3D-kweek van aanhangende cellen, waaronder menselijke mesenchymale stam-/stromale cellen (hMSC’s), HEK293T cellen en Vero-cellen. Om grootschalige expansie te bereiken, werd een tweetraps expansie uitgevoerd met 5 L en 15 L geroerde tank bioreactoren om 1,1 x 10¹⁰ hMSC’s op te leveren met een totale 128-voudige expansie binnen 9 dagen. De cellen werden geoogst door de microdragers volledig op te lossen, geconcentreerd, gewassen en geformuleerd met een celverwerkingssysteem op basis van een continue stroomcentrifuge, en vervolgens gealiquoteerd met een celvulsysteem. Vergeleken met 2D-vlakcultuur zijn er geen significante verschillen in de kwaliteit van hMSC’s die uit 3D-cultuur worden geoogst. We hebben deze oplosbare poreuze microdragers ook toegepast op andere populaire celtypen in de CGT-sector; in het bijzonder zijn HEK293T cellen en Vero-cellen gekweekt tot piekceldichtheden van respectievelijk 1,68 x 10 7 cellen/ml en 1,08 x 10⁷ cellen/ml. Deze studie biedt een protocol voor het gebruik van een bioprocestechnologieplatform dat gebruik maakt van de kenmerken van oplosbare microcarriers van GMP-kwaliteit en geavanceerde gesloten apparatuur om de productie van aanhangende cellen op industriële schaal te bereiken.

Introduction

De CGT-industrie is de afgelopen twee decennia getuige geweest van een exponentiële expansie. Verwacht wordt dat de evolutie van geneesmiddelen van de volgende generatie tal van refractaire ziekten zal behandelen en genezen¹. Sinds de eerste goedkeuring door de Food and Drug Administration (FDA) van een CGT-product, Kymriah, in 2017, is CGT-gerelateerd onderzoek en ontwikkeling in de wereld in een snel tempo blijven groeien, waarbij de FDA actieve aanvragen voor nieuwe geneesmiddelen voor CGT zag toenemen tot 500 in 2018². Er was voorspeld dat het aantal goedkeuringen van CGT-producten in de Verenigde Staten tegen 2030 waarschijnlijk 54-74 zal zijn^2.

Hoewel de snelle groei in CGT-onderzoek en -innovatie opwindend is, is er nog steeds een grote technologische kloof tussen laboratoriumonderzoek en productie op industriële schaal die deze veelbelovende geneesmiddelen zou kunnen leveren om zoveel patiënten te bereiken als nodig is tegen betaalbare kosten. De huidige processen die voor deze klinische proeven zijn toegepast, zijn vastgesteld in laboratoria voor kleinschalige experimenten, en er zijn aanzienlijke inspanningen nodig om de CGT-productie te verbeteren en te innoveren³. Er zijn veel soorten CGT-producten, de meeste gebaseerd op levende cellen, die allogeen, autoloog, gemanipuleerd of natuurlijk kunnen zijn. Deze levende geneesmiddelen zijn veel complexer dan kleine moleculaire entiteiten of biologische geneesmiddelen, waardoor grootschalige productie een grote uitdaging is ^4,5,6. In dit werk demonstreren we een grootschalig celproductieprotocol voor drie ankerplaatsafhankelijke cellen die op grote schaal worden toegepast in CGT’s. Deze omvatten menselijke mesenchymale stam-/stromale cellen (hMSC’s), die zijn gebruikt voor celgebaseerde therapie, en HEK293T cellen en Vero-cellen, die beide worden gebruikt om virussen te produceren voor de genetische manipulatie van het uiteindelijke therapeutische celproduct. Verankeringsafhankelijke cellen worden gewoonlijk gekweekt op vlakke systemen, die handmatige verwerking vereisen. Handmatige kweekmethoden vereisen echter een aanzienlijke hoeveelheid arbeid en zijn vatbaar voor contaminatie, wat de kwaliteit van het eindproduct in gevaar kan brengen. Bovendien is er geen in-line procescontrole, wat leidt tot aanzienlijke variabiliteit in kwaliteit tussen batches⁷. Als we stamceltherapie als voorbeeld nemen, met een veelbelovende pijplijn van meer dan 200 kandidaten voor stamceltherapie, wordt geschat dat er 300 biljoen hMSC’s per jaar nodig zouden zijn om aan de eisen van klinische toepassingen te voldoen⁸. Daarom is de grootschalige productie van therapeutische cellen een voorwaarde geworden om deze therapeutische interventies uit te voeren met zo’n hoge^celvraag9.

Om de tegenslagen van vlakke systemen te voorkomen, zijn inspanningen geleverd om grootschalige productieprocessen te ontwikkelen in bioreactoren met geroerde tanks met conventionele niet-oplosbare microcarriers^10,11,12,13, maar deze hebben te lijden onder ingewikkelde bereidingsprocedures en een lage efficiëntie bij het oogsten van^cellen14. Onlangs hebben we een oplosbare microdrager voor stamcelexpansie geïnnoveerd, met als doel de uitdagingen van het oogsten van cellen van conventionele niet-oplosbare commerciële microdragers te omzeilen¹⁵. Deze nieuwe, in de handel verkrijgbare 3D-oplosbare poreuze microdrager van GMP-kwaliteit, 3D TableTrix, heeft een groot potentieel getoond voor grootschalige celproductie. Inderdaad, 3D-kweek op basis van deze poreuze microdragers zou mogelijk gunstige biomimetische micro-omgevingen kunnen nabootsen om celadhesie, proliferatie, migratie en activering te bevorderen¹⁶. De poreuze structuren en onderling verbonden poriënnetwerken van microdragers kunnen een groter celadhesiegebied creëren en de uitwisseling van zuurstof, voedingsstoffen en metabolieten bevorderen, waardoor een optimaal substraat ontstaat voor in vitro celexpansie¹⁷. De hoge porositeit van deze GMP-grade 3D oplosbare poreuze microdragers maakt grootschalige expansie van hMSC’s mogelijk, en het vermogen om de cellen volledig op te lossen maakt het mogelijk om deze geëxpandeerde cellen efficiënt te oogsten¹⁸. Het is ook een product van GMP-kwaliteit en is geregistreerd als farmaceutische hulpstof bij het Chinese Center for Drug Evaluation (indieningsnummers: F20210000003 en F20200000496)¹⁹ en de FDA van de Verenigde Staten (FDA, VS; Drug Master Dossiernummer: 35481)²⁰.

Hier illustreren we een geautomatiseerd gesloten systeem voor celproductie op industriële schaal (ACISCP)¹⁸ met behulp van deze dispergeerbare en oplosbare poreuze microdragers voor hMSC-, HEK293T- en Vero-celexpansie. We bereikten een succesvolle tweeledige uitbreiding van hMSC’s (128 cumulatieve vouwexpansie in 9 dagen) van een 5 L bioreactor naar een 15 L bioreactor en verkregen uiteindelijk tot 1,1 x 10¹⁰ hMSC’s uit een enkele batch productie. De cellen werden geoogst door de microdragers volledig op te lossen, geconcentreerd, gewassen en geformuleerd met een celverwerkingssysteem op basis van een continue stroomcentrifuge, en vervolgens gealiquoteerd met een celvulsysteem. Verder hebben we de kwaliteit van hMSC-producten beoordeeld om de naleving te bevestigen. We demonstreerden ook de toepassing van deze oplosbare microcarriers voor de opgeschaalde productie van twee andere typen ankercellen, HEK293T cellen en Vero-cellen, die op grote schaal worden toegepast in de CGT-industrie. De piekceldichtheid van HEK293T cellen bereikte 1,68 x 10 7 cellen/ml, terwijl de piekdichtheid van Vero-cellen 1,08 x 10⁷ cellen/ml bereikte. Het ACISCP-systeem zou kunnen worden aangepast om een verscheidenheid aan aanhangende cellen te kweken, en het zou mogelijk een krachtig platform kunnen worden dat bijdraagt aan het versnellen van de industrialisatie van CGT.

Protocol

De menselijke navelstreng werd verkregen uit het Beijing Tsinghua Changgeng Hospital. Alle procedures en protocollen met betrekking tot het verwerven, isoleren en kweken van mesenchymale stamcellen uit de navelstreng (UCMSC’s) werden uitgevoerd met geïnformeerde toestemming en met goedkeuring van de ethische commissie van het Beijing Tsinghua Changgeng Hospital (dossiernummer 22035-4-02), en de procedures en protocollen voldeden aan de Verklaring van Helsinki van 1964 en de latere wijzigingen ervan of vergelijkbare ethi…

Representative Results

Het ACISCP-platform is een volledig gesloten systeem dat gebruik maakt van een reeks bioreactoren met geroerde tanks voor opschalingsuitbreiding, een celverwerkingssysteem voor geautomatiseerde celoogst en -formulering, en een celvulsysteem (Figuur 1). Hechtende cellen hechten zich aan de poreuze microdragers, die in de bioreactor kunnen worden gedispergeerd, waardoor de hangende kweek van aanhangende cellen wordt bereikt. Volgens het beschreven protocol werden ee…

Discussion

Zowel immunotherapie als stamceltherapie maken gebruik van levende cellen als medicijnen; Hun eindproducten mogen echter niet op dezelfde manier worden gezuiverd of gesteriliseerd als kleine moleculen of virussen. Daarom moet het principe van Quality by Design (QbD) altijd in gedachten worden gehouden en praktisch worden toegepast op het Chemical Manufacturing and Control (CMC)-proces tijdens de celproductie²³. Een volledig gesloten celkweeksysteem, evenals een verwerkingssysteem en een vulsysteem…

Materials

0.25% trypsin EDTA	BasalMedia	S310JV	Used for 2D cell harvest.
3D FloTrix Digest	CytoNiche Biotech	R001-500	This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix MSC Serum Free Medium	CytoNiche Biotech	RMZ112	This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix Single-Use Filtration Module	CytoNiche Biotech	R020-00-10	This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-03	Used as feed bag for 5 L bioreactor.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-01	Used as cell seeding or transfer bags.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-04	Used as feed bag for 15 L bioreactor.
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit	CytoNiche Biotech	PACK-01-01	This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells	CytoNiche Biotech	vivaPACK	This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system	CytoNiche Biotech	vivaPREP PLUS	This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit	CytoNiche Biotech	PREP-PLUS-00	This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 15 L	CytoNiche Biotech	FTVS15	This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 5 L	CytoNiche Biotech	FTVS05	This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L)	CytoNiche Biotech	R020-10-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L)	CytoNiche Biotech	R020-05-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.
3D TableTrix microcarriers G02	CytoNiche Biotech	G02-10-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.
3D TableTrix microcarriers V01	CytoNiche Biotech	V01-100-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.
3D TableTrix microcarriers W01	CytoNiche Biotech	W01-10-10g (single-use packaging); W01-200 (tablets)	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]
APC anti-human CD45 Antibody	BioLegend	368512	Used in flow cytometry for MSC identity assessment
Calcein-AM/PI Double Staining Kit	Dojindo	C542	Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	CAP-38	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in)	Saint-Gobain	374-250-3	Used for tube welding and disconnection.
CryoMACS Freezing Bag 50	Miltenyi Biotec	200-074-400	Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit.
Dimethyl Sulfate (DMSO)	Sigma	D2650-100mL	Used for preparation of cryopreservation solution.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	BasalMedia	L120KJ	Used for cultivation of HEK293T and Vero cells.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L)	DWK life sciences	218016357	Used for waste collection from the 5 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L)	DWK life sciences	218017353	Used for waste collection from the 15 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL)	DWK life sciences	218014459	Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.
EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	EZ500 ML-38-2	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Fetal bovine serum (FBS) superior quality	Wisent	086-150	Used for cultivation of HEK293T cells.
FITC anti-human CD14 Antibody	BioLegend	301804	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD34 Antibody	BioLegend	343504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody	BioLegend	328108	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Flow cytometry	Beckman Coulter	CytoFLEX	Used for cell identity assessment.
Fluorescence Cell Analyzer	Alit life science	Countstar Rigel S2	Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.
GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports	DWK life sciences	292632806	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Glucose Meter	Sinocare	6243578	Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium	Gibco	14025092	Used for preparation of digest solution.
Human Albumin 20% Behring (HSA)	CSL Behring	N/A	Used for preparation of wash buffer.
Inverted fluorescent microscope	OLYMBUS	CKX53SF	Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging.
Nalgene Measuring Cylinder (500 mL)	Thermo Scientific	3662-0500PK	Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.
Newborn calf serum (NBS) superfine	MINHAI BIO	SC101.02	Used for cultivation of Vero cells.
OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90031	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90041	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90021	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
PE anti-human CD105 Antibody	BioLegend	800504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD19 Antibody	BioLegend	302208	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344004	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human HLA-DR Antibody	BioLegend	307605	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Wisent	311-010-CL	Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.
Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in)	Saint-Gobain	ULTRA-C-125-2F	Used for solution transfering driven by peristaltic pumps.
Sterile Saline	Hopebiol	HBPP008-500	Used for preparation of wash buffer.
Trypzyme Recombinant Trypsin	BasalMedia	S342JV	This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.
Tube Sealer	Yingqi Biotech	Tube Sealer I	This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.
Tube Welder for PVC tubing	Chu Biotech	Tube Welder Micro I	Used for welding of PVC tubing.
Tube Welder for TPE tubing	Yingqi Biotech	Tube Welder I-V2	Used for welding of TPE tubing.
ViaStain AO / PI Viability Stains	Nexcelom	CS2-0106-25mL	Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.