Production de cellules à grande échelle à base de microporteurs poreux solubles de qualité GMP

Summary

Nous présentons ici un protocole permettant de réaliser la fabrication à grande échelle de cellules adhérentes grâce à un système entièrement fermé basé sur des microporteurs solubles de qualité GMP. La culture de cellules souches mésenchymateuses humaines, de cellules HEK293T et de cellules Vero a été validée et a répondu à la fois aux exigences quantitatives et aux critères de qualité de l’industrie de la thérapie cellulaire et génique.

Abstract

Les chercheurs de l’industrie de la thérapie cellulaire et génique (CGT) sont depuis longtemps confrontés à un défi de taille dans l’expansion efficace et à grande échelle des cellules. Pour remédier aux principales lacunes du système de culture planaire bidimensionnelle (2D), nous avons développé de manière innovante une plate-forme automatisée de production de cellules à l’échelle industrielle fermée (ACISCP) basée sur un microsupport poreux, soluble et de qualité GMP pour la culture 3D de cellules adhérentes, y compris les cellules souches mésenchymateuses/stromales humaines (CSMh), les cellules HEK293T et les cellules Vero. Pour réaliser une expansion à grande échelle, une expansion en deux étapes a été menée avec des bioréacteurs à cuve agitée de 5 L et 15 L pour produire 1,1 x^{10 10} hMSC avec une expansion globale de 128 fois en 9 jours. Les cellules ont été récoltées en dissolvant complètement les microtransporteurs, concentrées, lavées et formulées avec un système de traitement cellulaire à flux continu basé sur une centrifugeuse, puis alicitées avec un système de remplissage de cellules. Par rapport à la culture planaire 2D, il n’y a pas de différences significatives dans la qualité des CSMh récoltées à partir de la culture 3D. Nous avons également appliqué ces microporteurs poreux solubles à d’autres types de cellules populaires dans le secteur de la CGT ; plus précisément, les cellules HEK293T et les cellules Vero ont été cultivées à des densités cellulaires maximales de 1,68 x 10 7 cellules/mL et de 1,08 x 10⁷ cellules/mL, respectivement. Cette étude fournit un protocole pour l’utilisation d’une plate-forme d’ingénierie des bioprocédés exploitant les caractéristiques des microporteurs solubles de qualité GMP et des équipements fermés avancés pour réaliser la fabrication à l’échelle industrielle de cellules adhérentes.

Introduction

L’industrie de la CGT a connu une expansion exponentielle au cours des deux dernières décennies. On s’attend à ce que l’évolution des médicaments de nouvelle génération traite et guérisse de nombreuses maladies réfractaires¹. Depuis la première approbation par la Food and Drug Administration (FDA) d’un produit CGT, Kymriah, en 2017, la recherche et le développement liés à la CGT dans le monde ont continué de croître à un rythme rapide, la FDA voyant le nombre de demandes actives de nouveaux médicaments expérimentaux pour la CGT augmenter à 500 en 2018². Il avait été prédit que le nombre d’approbations de produits CGT serait probablement de 54 à 74 aux États-Unis d’ici 2030².

Bien que la croissance rapide de la recherche et de l’innovation en matière de CGT soit passionnante, il existe encore un écart technologique important entre la recherche en laboratoire et la fabrication à l’échelle industrielle qui pourrait permettre à ces médicaments prometteurs d’atteindre autant de patients que nécessaire à des coûts abordables. Les processus actuels adoptés pour ces essais cliniques ont été mis en place dans des laboratoires pour des expériences à petite échelle, et des efforts importants sont nécessaires pour améliorer et innover dans la fabrication de CGT³. Il existe de nombreux types de produits CGT, la plupart d’entre eux basés sur des cellules vivantes, qui peuvent être allogéniques, autologiques, modifiés ou naturels. Ces médicaments vivants sont beaucoup plus complexes que les petites entités moléculaires ou les produits biologiques, ce qui fait de la fabrication à grande échelle un défi de taille ^4,5,6. Dans ce travail, nous démontrons un protocole de production cellulaire à grande échelle pour trois cellules dépendantes de l’ancrage qui sont largement appliquées dans les CGT. Il s’agit notamment des cellules souches mésenchymateuses/stromales humaines (CSMh), qui ont été utilisées pour la thérapie cellulaire, ainsi que des cellules HEK293T et des cellules Vero, qui sont toutes deux utilisées pour produire des virus pour le génie génétique du produit cellulaire thérapeutique final. Les cellules dépendantes de l’ancrage sont généralement cultivées sur des systèmes planaires, qui nécessitent un traitement manuel. Cependant, les méthodes de culture manuelle nécessitent une quantité importante de main-d’œuvre et sont sujettes à la contamination, ce qui peut compromettre la qualité du produit final. De plus, il n’y a pas de contrôle de processus en ligne, ce qui entraîne une variabilité substantielle de la qualité entre les lots⁷. Si l’on prend l’exemple de la thérapie par cellules souches, avec un pipeline prometteur de plus de 200 candidats thérapies à base de cellules souches, on estime que 300 trillions de CSMh seraient nécessaires par an pour répondre aux demandes d’applications cliniques⁸. Par conséquent, la fabrication à grande échelle de cellules thérapeutiques est devenue une condition préalable à la réalisation de ces interventions thérapeutiques avec une demande cellulaire aussi élevée⁹.

Pour éviter les revers des systèmes planaires, des efforts ont été faits pour développer des procédés de fabrication à grande échelle dans des bioréacteurs à cuve agitée avec des microporteurs conventionnels non solubles 10,11,12,13^, mais ceux-ci souffrent de procédures de préparation compliquées et d’une faible efficacité de récolte des cellules ¹⁴. Récemment, nous avons mis au point un microtransporteur soluble pour l’expansion des cellules souches, dans le but de contourner les défis liés à la récolte de cellules à partir de microporteurs commerciaux conventionnels non solubles¹⁵. Ce nouveau microporteur poreux soluble 3D de qualité GMP, 3D TableTrix, disponible dans le commerce, a montré un grand potentiel pour la production de cellules à grande échelle. En effet, la culture 3D basée sur ces microporteurs poreux pourrait potentiellement recréer des microenvironnements biomimétiques favorables pour favoriser l’adhésion, la prolifération, la migration et l’activation des^cellules16. Les structures poreuses et les réseaux de pores interconnectés de microporteurs pourraient créer une plus grande surface d’adhésion cellulaire et favoriser l’échange d’oxygène, de nutriments et de métabolites, créant ainsi un substrat optimal pour l’expansion cellulaire in vitro ¹⁷. La porosité élevée de ces microporteurs poreux solubles 3D de qualité GMP permet une expansion à grande échelle des CSMh, et la capacité des cellules à être complètement dissoutes permet la récolte efficace de ces cellules expansées¹⁸. Il s’agit également d’un produit de qualité GMP et a été enregistré en tant qu’excipient pharmaceutique auprès du Centre chinois d’évaluation des médicaments (numéros de dépôt : F20210000003 et F20200000496)¹⁹ et de la FDA des États-Unis (FDA, États-Unis ; Numéro de dossier principal de la drogue : 35481)²⁰.

Ici, nous illustrons un système automatisé de production de cellules à l’échelle industrielle fermée (ACISCP)¹⁸ utilisant ces microporteurs poreux dispersibles et solubles pour l’expansion des cellules hMSC, HEK293T et Vero. Nous avons réussi une expansion à deux niveaux des hMSC (128 plis cumulés en 9 jours) d’un bioréacteur de 5 L à un bioréacteur de 15 L et avons finalement obtenu jusqu’à 1,1 x 10¹⁰ hMSC à partir d’un seul lot de production. Les cellules ont été récoltées en dissolvant complètement les microtransporteurs, concentrées, lavées et formulées avec un système de traitement cellulaire à flux continu basé sur une centrifugeuse, puis alicitées avec un système de remplissage de cellules. De plus, nous avons évalué la qualité des produits hMSC pour confirmer leur conformité. Nous avons également démontré l’application de ces microporteurs solubles pour la production à grande échelle de deux autres types de cellules d’ancrage, les cellules HEK293T et les cellules Vero, qui sont largement utilisées dans l’industrie CGT. La densité cellulaire maximale des cellules HEK293T a atteint 1,68 x 10 7 cellules/mL, tandis que la densité maximale des cellules Vero a atteint 1,08 x 10⁷ cellules/mL. Le système ACISCP pourrait être adapté à la culture d’une variété de cellules adhérentes, et il pourrait potentiellement devenir une plate-forme puissante contribuant à accélérer l’industrialisation de la CGT.

Protocol

Le cordon ombilical humain a été obtenu à l’hôpital Tsinghua Changgeng de Pékin. Toutes les procédures et tous les protocoles concernant l’acquisition, l’isolement et la culture des cellules souches mésenchymateuses du cordon ombilical humain (UCMSCs) ont été effectués avec le consentement éclairé et avec l’approbation du Comité d’éthique de l’hôpital Tsinghua Changgeng de Beijing (numéro de dossier 22035-4-02), et les procédures et protocoles étaient conformes à la déclaration d’Helsink…

Representative Results

La plate-forme ACISCP est un système entièrement fermé qui utilise une série de bioréacteurs à cuve agitée pour l’expansion à grande échelle, un système de traitement cellulaire pour la récolte et la formulation automatisées des cellules, et un système de remplissage cellulaire (Figure 1). Les cellules adhérentes se fixent aux microporteurs poreux, qui peuvent être dispersés dans le bioréacteur, réalisant ainsi la culture en suspension des cellules adhérentes. <p cla…

Discussion

L’immunothérapie et la thérapie par cellules souches utilisent toutes deux des cellules vivantes comme médicaments ; Cependant, leurs produits finaux ne doivent pas être purifiés ou stérilisés de la même manière que les petites molécules ou les virus. Par conséquent, le principe de la qualité par la conception (QbD) doit toujours être gardé à l’esprit et appliqué dans la pratique au processus de fabrication et de contrôle des produits chimiques (CMC) lors de la production de cellules<sup class="xref…

Materials

0.25% trypsin EDTA	BasalMedia	S310JV	Used for 2D cell harvest.
3D FloTrix Digest	CytoNiche Biotech	R001-500	This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix MSC Serum Free Medium	CytoNiche Biotech	RMZ112	This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix Single-Use Filtration Module	CytoNiche Biotech	R020-00-10	This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-03	Used as feed bag for 5 L bioreactor.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-01	Used as cell seeding or transfer bags.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-04	Used as feed bag for 15 L bioreactor.
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit	CytoNiche Biotech	PACK-01-01	This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells	CytoNiche Biotech	vivaPACK	This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system	CytoNiche Biotech	vivaPREP PLUS	This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit	CytoNiche Biotech	PREP-PLUS-00	This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 15 L	CytoNiche Biotech	FTVS15	This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 5 L	CytoNiche Biotech	FTVS05	This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L)	CytoNiche Biotech	R020-10-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L)	CytoNiche Biotech	R020-05-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.
3D TableTrix microcarriers G02	CytoNiche Biotech	G02-10-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.
3D TableTrix microcarriers V01	CytoNiche Biotech	V01-100-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.
3D TableTrix microcarriers W01	CytoNiche Biotech	W01-10-10g (single-use packaging); W01-200 (tablets)	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]
APC anti-human CD45 Antibody	BioLegend	368512	Used in flow cytometry for MSC identity assessment
Calcein-AM/PI Double Staining Kit	Dojindo	C542	Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	CAP-38	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in)	Saint-Gobain	374-250-3	Used for tube welding and disconnection.
CryoMACS Freezing Bag 50	Miltenyi Biotec	200-074-400	Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit.
Dimethyl Sulfate (DMSO)	Sigma	D2650-100mL	Used for preparation of cryopreservation solution.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	BasalMedia	L120KJ	Used for cultivation of HEK293T and Vero cells.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L)	DWK life sciences	218016357	Used for waste collection from the 5 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L)	DWK life sciences	218017353	Used for waste collection from the 15 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL)	DWK life sciences	218014459	Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.
EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	EZ500 ML-38-2	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Fetal bovine serum (FBS) superior quality	Wisent	086-150	Used for cultivation of HEK293T cells.
FITC anti-human CD14 Antibody	BioLegend	301804	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD34 Antibody	BioLegend	343504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody	BioLegend	328108	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Flow cytometry	Beckman Coulter	CytoFLEX	Used for cell identity assessment.
Fluorescence Cell Analyzer	Alit life science	Countstar Rigel S2	Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.
GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports	DWK life sciences	292632806	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Glucose Meter	Sinocare	6243578	Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium	Gibco	14025092	Used for preparation of digest solution.
Human Albumin 20% Behring (HSA)	CSL Behring	N/A	Used for preparation of wash buffer.
Inverted fluorescent microscope	OLYMBUS	CKX53SF	Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging.
Nalgene Measuring Cylinder (500 mL)	Thermo Scientific	3662-0500PK	Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.
Newborn calf serum (NBS) superfine	MINHAI BIO	SC101.02	Used for cultivation of Vero cells.
OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90031	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90041	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90021	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
PE anti-human CD105 Antibody	BioLegend	800504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD19 Antibody	BioLegend	302208	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344004	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human HLA-DR Antibody	BioLegend	307605	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Wisent	311-010-CL	Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.
Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in)	Saint-Gobain	ULTRA-C-125-2F	Used for solution transfering driven by peristaltic pumps.
Sterile Saline	Hopebiol	HBPP008-500	Used for preparation of wash buffer.
Trypzyme Recombinant Trypsin	BasalMedia	S342JV	This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.
Tube Sealer	Yingqi Biotech	Tube Sealer I	This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.
Tube Welder for PVC tubing	Chu Biotech	Tube Welder Micro I	Used for welding of PVC tubing.
Tube Welder for TPE tubing	Yingqi Biotech	Tube Welder I-V2	Used for welding of TPE tubing.
ViaStain AO / PI Viability Stains	Nexcelom	CS2-0106-25mL	Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.