Großtechnische Zellproduktion auf Basis von auflösbaren porösen Mikroträgern in GMP-Qualität

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Herstellung von adhärenten Zellen in großem Maßstab durch ein vollständig geschlossenes System auf der Basis von auflösbaren Mikroträgern in GMP-Qualität zu erreichen. Die Kultivierung von humanen mesenchymalen Stammzellen, HEK293T Zellen und Vero-Zellen wurde validiert und erfüllte sowohl die Quantitätsanforderungen als auch die Qualitätskriterien für die Zell- und Gentherapieindustrie.

Abstract

Forscher in der Zell- und Gentherapie-Industrie (CGT) stehen seit langem vor einer gewaltigen Herausforderung bei der effizienten und großflächigen Vermehrung von Zellen. Um die primären Mängel des zweidimensionalen (2D) planaren Kultivierungssystems zu beheben, haben wir auf innovative Weise eine automatisierte Plattform für die geschlossene Zellproduktion im industriellen Maßstab (ACISCP) entwickelt, die auf einem GMP-tauglichen, auflösbaren und porösen Mikroträger für die 3D-Kultur adhärenter Zellen basiert, einschließlich humaner mesenchymaler Stamm-/Stromazellen (hMSCs), HEK293T Zellen und Vero-Zellen. Um eine großflächige Expansion zu erreichen, wurde eine zweistufige Expansion mit 5 L und 15 L Rührkessel-Bioreaktoren durchgeführt, um 1,1 x^{10 10} hMSCs mit einer insgesamt 128-fachen Expansion innerhalb von 9 Tagen zu erhalten. Die Zellen wurden geerntet, indem die Mikroträger vollständig aufgelöst wurden, konzentriert, gewaschen und mit einem auf einer kontinuierlichen Zentrifuge basierenden Zellverarbeitungssystem formuliert und dann mit einem Zellfüllsystem aliquotiert. Im Vergleich zu planaren 2D-Kulturen gibt es keine signifikanten Unterschiede in der Qualität von hMSCs, die aus 3D-Kulturen gewonnen werden. Wir haben diese auflösbaren porösen Mikroträger auch auf andere beliebte Zelltypen im CGT-Bereich angewendet; Insbesondere wurden HEK293T Zellen und Vero-Zellen zu Spitzenzelldichten von 1,68 x 10 7 Zellen/ml bzw. 1,08 x 10⁷ Zellen/ml kultiviert. Diese Studie liefert ein Protokoll für den Einsatz einer bioverfahrenstechnischen Plattform, die die Eigenschaften von auflösbaren Mikroträgern in GMP-Qualität und fortschrittlichen geschlossenen Geräten nutzt, um die Herstellung adhärenter Zellen im industriellen Maßstab zu erreichen.

Introduction

Die CGT-Branche hat in den letzten zwei Jahrzehnten eine exponentielle Expansion erlebt. Es wird erwartet, dass die Entwicklung von Medikamenten der nächsten Generation zahlreiche refraktäre Erkrankungen behandeln und heilen wird¹. Seit der ersten Zulassung eines CGT-Produkts, Kymriah, durch die Food and Drug Administration (FDA) im Jahr 2017 ist die CGT-bezogene Forschung und Entwicklung weltweit weiterhin rasant gewachsen, wobei die FDA einen Anstieg der aktiven Anträge auf neue Prüfpräparate für CGT auf 500 im Jahr 2018 verzeichnete². Es wurde prognostiziert, dass die Zahl der Zulassungen von CGT-Produkten in den Vereinigten Staaten bis 2030 wahrscheinlich 54-74 betragen wird².

Während das schnelle Wachstum der CGT-Forschung und -Innovation aufregend ist, gibt es immer noch eine große technologische Lücke zwischen der Laborforschung und der Herstellung im industriellen Maßstab, die diese vielversprechenden Medikamente liefern könnte, um so viele Patienten wie nötig zu erschwinglichen Kosten zu erreichen. Die aktuellen Prozesse, die für diese klinischen Studien verwendet werden, wurden in Labors für Experimente in kleinem Maßstab etabliert, und es sind erhebliche Anstrengungen erforderlich, um die CGT-Herstellung zu verbessern und zu erneuern³. Es gibt viele Arten von CGT-Produkten, von denen die meisten auf lebenden Zellen basieren, die allogen, autolog, technisch verändert oder natürlich sein können. Diese lebenden Arzneimittel sind viel komplexer als kleine molekulare Einheiten oder Biologika, was die Herstellung in großem Maßstab zu einer großen Herausforderung macht ^4,5,6. In dieser Arbeit demonstrieren wir ein großflächiges Zellproduktionsprotokoll für drei verankerungsabhängige Zellen, die in CGTs weit verbreitet sind. Dazu gehören humane mesenchymale Stamm-/Stromazellen (hMSCs), die für die zellbasierte Therapie verwendet wurden, sowie HEK293T- und Vero-Zellen, die beide zur Herstellung von Viren für die Gentechnik des endgültigen therapeutischen Zellprodukts verwendet werden. Verankerungsabhängige Zellen werden üblicherweise auf planaren Systemen kultiviert, die eine manuelle Verarbeitung erfordern. Manuelle Kultivierungsmethoden erfordern jedoch einen erheblichen Arbeitsaufwand und sind anfällig für Verunreinigungen, die die Qualität des Endprodukts beeinträchtigen können. Darüber hinaus gibt es keine Inline-Prozesskontrolle, was zu erheblichen Qualitätsschwankungen zwischen den Chargen^{führt 7}. Am Beispiel der Stammzelltherapie mit einer vielversprechenden Pipeline von über 200 Stammzelltherapiekandidaten wird geschätzt, dass 300 Billionen hMSCs pro Jahr benötigt würden, um den Anforderungen klinischer Anwendungen gerecht zu werden⁸. Daher ist die Herstellung von therapeutischen Zellen in großem Maßstab zu einer Voraussetzung geworden, um diese therapeutischen Eingriffe mit einem so hohen Zellbedarf durchzuführen⁹.

Um die Rückschläge planarer Systeme auszuschließen, wurden Anstrengungen unternommen, um großtechnische Herstellungsprozesse in Rührkessel-Bioreaktoren mit konventionellen, nicht löslichen Mikroträgern zu entwickeln 10,11,12,13^, aber diese leiden unter komplizierten Präparationsverfahren und geringer Zellernteeffizienz ¹⁴. Kürzlich haben wir einen auflösbaren Mikroträger für die Stammzellexpansion entwickelt, der darauf abzielt, die Herausforderungen der Zellernte aus herkömmlichen, nicht löslichen kommerziellen Mikroträgern zu umgehen¹⁵. Dieser neuartige, kommerziell erhältliche 3D-poröse 3D-Mikroträger in GMP-Qualität, 3D TableTrix, hat ein großes Potenzial für die Produktion von Zellen im großen Maßstab gezeigt. In der Tat könnte eine 3D-Kultur, die auf diesen porösen Mikroträgern basiert, potenziell günstige biomimetische Mikroumgebungen nachbilden, um die Adhäsion, Proliferation, Migration und Aktivierung von Zellen zu fördern¹⁶. Die porösen Strukturen und miteinander verbundenen Porennetzwerke von Mikrocarriern könnten eine größere Zelladhäsionsfläche schaffen und den Austausch von Sauerstoff, Nährstoffen und Metaboliten fördern, wodurch ein optimales Substrat für die In-vitro-Zellexpansion geschaffen^{wird 17}. Die hohe Porosität dieser löslichen porösen 3D-Mikroträger in GMP-Qualität ermöglicht eine großflächige Expansion von hMSCs, und die Fähigkeit, die Zellen vollständig aufzulösen, ermöglicht die effiziente Ernte dieser expandierten Zellen¹⁸. Es ist auch ein GMP-Produkt und wurde als pharmazeutischer Hilfsstoff beim chinesischen Zentrum für Arzneimittelbewertung (Anmeldenummern: F20210000003 und F20200000496)¹⁹ und der FDA der Vereinigten Staaten (FDA, USA; Nummer der Arzneimittelstammdatei: 35481)²⁰.

Hier veranschaulichen wir ein automatisiertes geschlossenes Zellproduktionssystem im industriellen Maßstab (ACISCP)¹⁸, das diese dispergierbaren und auflösbaren porösen Mikroträger für die Expansion von hMSC-, HEK293T-Zellen und Vero-Zellen verwendet. Wir erreichten eine erfolgreiche zweistufige Expansion von hMSCs (128 kumulative Fold Expansion in 9 Tagen) von einem 5-l-Bioreaktor zu einem 15-l-Bioreaktor und erhielten schließlich bis zu 1,1 x^{10 10} hMSCs aus einer einzigen Produktionscharge. Die Zellen wurden geerntet, indem die Mikroträger vollständig aufgelöst wurden, konzentriert, gewaschen und mit einem auf einer kontinuierlichen Flusszentrifuge basierenden Zellverarbeitungssystem formuliert und dann mit einem Zellfüllsystem aliquotiert. Darüber hinaus haben wir die Qualität der hMSC-Produkte bewertet, um die Einhaltung der Vorschriften zu bestätigen. Wir demonstrierten auch die Anwendung dieser auflösbaren Mikroträger für die skalierte Produktion von zwei anderen Arten von Verankerungszellen, HEK293T Zellen und Vero-Zellen, die in der CGT-Industrie weit verbreitet sind. Die maximale Zelldichte von HEK293T Zellen erreichte 1,68 x 10 7 Zellen/ml, während die maximale Dichte der Vero-Zellen 1,08 x 10⁷ Zellen/ml erreichte. Das ACISCP-System könnte für die Kultivierung einer Vielzahl von adhärenten Zellen angepasst werden und könnte möglicherweise zu einer leistungsstarken Plattform werden, die dazu beiträgt, die Industrialisierung von CGT zu beschleunigen.

Protocol

Die menschliche Nabelschnur wurde aus dem Pekinger Tsinghua Changgeng Krankenhaus entnommen. Alle Verfahren und Protokolle in Bezug auf die Gewinnung, Isolierung und Kultur von mesenchymalen Stammzellen der menschlichen Nabelschnur (UCMSCs) wurden mit informierter Zustimmung und mit Genehmigung der Ethikkommission des Beijing Tsinghua Changgeng Hospital (Aktenzeichen 22035-4-02) durchgeführt, und die Verfahren und Protokolle entsprachen der Deklaration von Helsinki von 1964 und ihren späteren Änderungen oder vergleich…

Representative Results

Bei der ACISCP-Plattform handelt es sich um ein vollständig geschlossenes System, das eine Reihe von Rührkessel-Bioreaktoren für die Scale-up-Expansion, ein Zellverarbeitungssystem für die automatisierte Zellernte und -formulierung sowie ein Zellfüllsystem verwendet (Abbildung 1). Adhärente Zellen heften sich an die porösen Mikrocarrier, die in den Bioreaktor dispergiert werden können, wodurch die suspendierte Kultivierung adhärenter Zellen erreicht wird. <p class="jove_content"…

Discussion

Sowohl bei der Immuntherapie als auch bei der Stammzelltherapie werden lebende Zellen als Medikamente verwendet. Ihre Endprodukte sollten jedoch nicht auf die gleiche Weise gereinigt oder sterilisiert werden wie kleine Moleküle oder Viren. Daher sollte das Prinzip von Quality by Design (QbD) immer im Hinterkopf behalten und praktisch auf den Prozess der chemischen Herstellung und Kontrolle (CMC) während der Zellproduktion angewendet werden²³. Ein vollständig geschlossenes Zellkultursystem sowie…

Materials

0.25% trypsin EDTA	BasalMedia	S310JV	Used for 2D cell harvest.
3D FloTrix Digest	CytoNiche Biotech	R001-500	This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix MSC Serum Free Medium	CytoNiche Biotech	RMZ112	This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix Single-Use Filtration Module	CytoNiche Biotech	R020-00-10	This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-03	Used as feed bag for 5 L bioreactor.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-01	Used as cell seeding or transfer bags.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-04	Used as feed bag for 15 L bioreactor.
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit	CytoNiche Biotech	PACK-01-01	This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells	CytoNiche Biotech	vivaPACK	This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system	CytoNiche Biotech	vivaPREP PLUS	This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit	CytoNiche Biotech	PREP-PLUS-00	This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 15 L	CytoNiche Biotech	FTVS15	This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 5 L	CytoNiche Biotech	FTVS05	This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L)	CytoNiche Biotech	R020-10-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L)	CytoNiche Biotech	R020-05-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.
3D TableTrix microcarriers G02	CytoNiche Biotech	G02-10-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.
3D TableTrix microcarriers V01	CytoNiche Biotech	V01-100-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.
3D TableTrix microcarriers W01	CytoNiche Biotech	W01-10-10g (single-use packaging); W01-200 (tablets)	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]
APC anti-human CD45 Antibody	BioLegend	368512	Used in flow cytometry for MSC identity assessment
Calcein-AM/PI Double Staining Kit	Dojindo	C542	Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	CAP-38	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in)	Saint-Gobain	374-250-3	Used for tube welding and disconnection.
CryoMACS Freezing Bag 50	Miltenyi Biotec	200-074-400	Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit.
Dimethyl Sulfate (DMSO)	Sigma	D2650-100mL	Used for preparation of cryopreservation solution.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	BasalMedia	L120KJ	Used for cultivation of HEK293T and Vero cells.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L)	DWK life sciences	218016357	Used for waste collection from the 5 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L)	DWK life sciences	218017353	Used for waste collection from the 15 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL)	DWK life sciences	218014459	Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.
EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	EZ500 ML-38-2	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Fetal bovine serum (FBS) superior quality	Wisent	086-150	Used for cultivation of HEK293T cells.
FITC anti-human CD14 Antibody	BioLegend	301804	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD34 Antibody	BioLegend	343504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody	BioLegend	328108	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Flow cytometry	Beckman Coulter	CytoFLEX	Used for cell identity assessment.
Fluorescence Cell Analyzer	Alit life science	Countstar Rigel S2	Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.
GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports	DWK life sciences	292632806	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Glucose Meter	Sinocare	6243578	Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium	Gibco	14025092	Used for preparation of digest solution.
Human Albumin 20% Behring (HSA)	CSL Behring	N/A	Used for preparation of wash buffer.
Inverted fluorescent microscope	OLYMBUS	CKX53SF	Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging.
Nalgene Measuring Cylinder (500 mL)	Thermo Scientific	3662-0500PK	Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.
Newborn calf serum (NBS) superfine	MINHAI BIO	SC101.02	Used for cultivation of Vero cells.
OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90031	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90041	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90021	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
PE anti-human CD105 Antibody	BioLegend	800504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD19 Antibody	BioLegend	302208	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344004	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human HLA-DR Antibody	BioLegend	307605	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Wisent	311-010-CL	Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.
Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in)	Saint-Gobain	ULTRA-C-125-2F	Used for solution transfering driven by peristaltic pumps.
Sterile Saline	Hopebiol	HBPP008-500	Used for preparation of wash buffer.
Trypzyme Recombinant Trypsin	BasalMedia	S342JV	This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.
Tube Sealer	Yingqi Biotech	Tube Sealer I	This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.
Tube Welder for PVC tubing	Chu Biotech	Tube Welder Micro I	Used for welding of PVC tubing.
Tube Welder for TPE tubing	Yingqi Biotech	Tube Welder I-V2	Used for welding of TPE tubing.
ViaStain AO / PI Viability Stains	Nexcelom	CS2-0106-25mL	Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.