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Production de cellules à grande échelle à base de microporteurs poreux solubles de qualité GMP

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DOI :

10.3791/65469

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7 juillet 2023

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1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, 2Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd.

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole permettant de réaliser la fabrication à grande échelle de cellules adhérentes grâce à un système entièrement fermé basé sur des microporteurs solubles de qualité GMP. La culture de cellules souches mésenchymateuses humaines, de cellules HEK293T et de cellules Vero a été validée et a répondu à la fois aux exigences quantitatives et aux critères de qualité de l’industrie de la thérapie cellulaire et génique.

Résumé

Les chercheurs de l’industrie de la thérapie cellulaire et génique (CGT) sont depuis longtemps confrontés à un défi de taille dans l’expansion efficace et à grande échelle des cellules. Pour remédier aux principales lacunes du système de culture planaire bidimensionnelle (2D), nous avons développé de manière innovante une plate-forme automatisée de production de cellules à l’échelle industrielle fermée (ACISCP) basée sur un microsupport poreux, soluble et de qualité GMP pour la culture 3D de cellules adhérentes, y compris les cellules souches mésenchymateuses/stromales humaines (CSMh), les cellules HEK293T et les cellules Vero. Pour réaliser une expansion à grande échelle, une expansion en deux étapes a été menée avec des bioréacteurs à cuve agitée de 5 L et 15 L pour produire 1,1 x10 10 hMSC avec une expansion globale de 128 fois en 9 jours. Les cellules ont été récoltées en dissolvant complètement les microtransporteurs, concentrées, lavées et formulées avec un système de traitement cellulaire à flux continu basé sur une centrifugeuse, puis alicitées avec un système de remplissage de cellules. Par rapport à la culture planaire 2D, il n’y a pas de différences significatives dans la qualité des CSMh récoltées à partir de la culture 3D. Nous avons également appliqué ces microporteurs poreux solubles à d’autres types de cellules populaires dans le secteur de la CGT ; plus précisément, les cellules HEK293T et les cellules Vero ont été cultivées à des densités cellulaires maximales de 1,68 x 10 7 cellules/mL et de 1,08 x 107 cellules/mL, respectivement. Cette étude fournit un protocole pour l’utilisation d’une plate-forme d’ingénierie des bioprocédés exploitant les caractéristiques des microporteurs solubles de qualité GMP et des équipements fermés avancés pour réaliser la fabrication à l’échelle industrielle de cellules adhérentes.

Introduction

L’industrie de la CGT a connu une expansion exponentielle au cours des deux dernières décennies. On s’attend à ce que l’évolution des médicaments de nouvelle génération traite et guérisse de nombreuses maladies réfractaires1. Depuis la première approbation par la Food and Drug Administration (FDA) d’un produit CGT, Kymriah, en 2017, la recherche et le développement liés à la CGT dans le monde ont continué de croître à un rythme rapide, la FDA voyant le nombre de demandes actives de nouveaux médicaments expérimentaux pour la CGT augmenter à 500 en 20182. Il avait été prédit que le nombre d’approbations de produits CGT serait probablement de 54 à 74 aux États-Unis d’ici 20302.

Bien que la croissance rapide de la recherche et de l’innovation en matière de CGT soit passionnante, il existe encore un écart technologique important entre la recherche en laboratoire et la fabrication à l’échelle industrielle qui pourrait permettre à ces médicaments prometteurs d’atteindre autant de patients que nécessaire à des coûts abordables. Les processus actuels adoptés pour ces essais cliniques ont été mis en place dans des laboratoires pour des expériences à petite échelle, et des efforts importants sont nécessaires pour améliorer et innover dans la fabrication de CGT3. Il existe de nombreux types de produits CGT, la plupart d’entre eux basés sur des cellules vivantes, qui peuvent être allogéniques, autologiques, modifiés ou naturels. Ces médicaments vivants sont beaucoup plus complexes que les petites entités moléculaires ou les produits biologiques, ce qui fait de la fabrication à grande échelle un défi de taille 4,5,6. Dans ce travail, nous démontrons un protocole de production cellulaire à grande échelle pour trois cellules dépendantes de l’ancrage qui sont largement appliquées dans les CGT. Il s’agit notamment des cellules souches mésenchymateuses/stromales humaines (CSMh), qui ont été utilisées pour la thérapie cellulaire, ainsi que des cellules HEK293T et des cellules Vero, qui sont toutes deux utilisées pour produire des virus pour le génie génétique du produit cellulaire thérapeutique final. Les cellules dépendantes de l’ancrage sont généralement cultivées sur des systèmes planaires, qui nécessitent un traitement manuel. Cependant, les méthodes de culture manuelle nécessitent une quantité importante de main-d’œuvre et sont sujettes à la contamination, ce qui peut compromettre la qualité du produit final. De plus, il n’y a pas de contrôle de processus en ligne, ce qui entraîne une variabilité substantielle de la qualité entre les lots7. Si l’on prend l’exemple de la thérapie par cellules souches, avec un pipeline prometteur de plus de 200 candidats thérapies à base de cellules souches, on estime que 300 trillions de CSMh seraient nécessaires par an pour répondre aux demandes d’applications cliniques8. Par conséquent, la fabrication à grande échelle de cellules thérapeutiques est devenue une condition préalable à la réalisation de ces interventions thérapeutiques avec une demande cellulaire aussi élevée9.

Pour éviter les revers des systèmes planaires, des efforts ont été faits pour développer des procédés de fabrication à grande échelle dans des bioréacteurs à cuve agitée avec des microporteurs conventionnels non solubles 10,11,12,13, mais ceux-ci souffrent de procédures de préparation compliquées et d’une faible efficacité de récolte des cellules 14. Récemment, nous avons mis au point un microtransporteur soluble pour l’expansion des cellules souches, dans le but de contourner les défis liés à la récolte de cellules à partir de microporteurs commerciaux conventionnels non solubles15. Ce nouveau microporteur poreux soluble 3D de qualité GMP, 3D TableTrix, disponible dans le commerce, a montré un grand potentiel pour la production de cellules à grande échelle. En effet, la culture 3D basée sur ces microporteurs poreux pourrait potentiellement recréer des microenvironnements biomimétiques favorables pour favoriser l’adhésion, la prolifération, la migration et l’activation descellules16. Les structures poreuses et les réseaux de pores interconnectés de microporteurs pourraient créer une plus grande surface d’adhésion cellulaire et favoriser l’échange d’oxygène, de nutriments et de métabolites, créant ainsi un substrat optimal pour l’expansion cellulaire in vitro 17. La porosité élevée de ces microporteurs poreux solubles 3D de qualité GMP permet une expansion à grande échelle des CSMh, et la capacité des cellules à être complètement dissoutes permet la récolte efficace de ces cellules expansées18. Il s’agit également d’un produit de qualité GMP et a été enregistré en tant qu’excipient pharmaceutique auprès du Centre chinois d’évaluation des médicaments (numéros de dépôt : F20210000003 et F20200000496)19 et de la FDA des États-Unis (FDA, États-Unis ; Numéro de dossier principal de la drogue : 35481)20.

Ici, nous illustrons un système automatisé de production de cellules à l’échelle industrielle fermée (ACISCP)18 utilisant ces microporteurs poreux dispersibles et solubles pour l’expansion des cellules hMSC, HEK293T et Vero. Nous avons réussi une expansion à deux niveaux des hMSC (128 plis cumulés en 9 jours) d’un bioréacteur de 5 L à un bioréacteur de 15 L et avons finalement obtenu jusqu’à 1,1 x 1010 hMSC à partir d’un seul lot de production. Les cellules ont été récoltées en dissolvant complètement les microtransporteurs, concentrées, lavées et formulées avec un système de traitement cellulaire à flux continu basé sur une centrifugeuse, puis alicitées avec un système de remplissage de cellules. De plus, nous avons évalué la qualité des produits hMSC pour confirmer leur conformité. Nous avons également démontré l’application de ces microporteurs solubles pour la production à grande échelle de deux autres types de cellules d’ancrage, les cellules HEK293T et les cellules Vero, qui sont largement utilisées dans l’industrie CGT. La densité cellulaire maximale des cellules HEK293T a atteint 1,68 x 10 7 cellules/mL, tandis que la densité maximale des cellules Vero a atteint 1,08 x 107 cellules/mL. Le système ACISCP pourrait être adapté à la culture d’une variété de cellules adhérentes, et il pourrait potentiellement devenir une plate-forme puissante contribuant à accélérer l’industrialisation de la CGT.

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Protocole

Le cordon ombilical humain a été obtenu à l’hôpital Tsinghua Changgeng de Pékin. Toutes les procédures et tous les protocoles concernant l’acquisition, l’isolement et la culture des cellules souches mésenchymateuses du cordon ombilical humain (UCMSCs) ont été effectués avec le consentement éclairé et avec l’approbation du Comité d’éthique de l’hôpital Tsinghua Changgeng de Beijing (numéro de dossier 22035-4-02), et les procédures et protocoles étaient conformes à la déclaration d’Helsinki de 1964 et à ses amendements ultérieurs ou à des normes éthiques comparables.

1. Culture monocouche de CSMh, de cellules HEK293T et de cellules Vero

  1. Isolez les UCMSC humains primaires de la gelée de Wharton selon la méthode décrite21. Utiliser un milieu de culture hMSC sans sérum (SF) pour l’isolement et la croissance des UCMSC primaires, récolter les cellules sur le passage 2 et les cryoconserver en tant que banque de cellules maîtresses (MCB).
  2. Inoculer 6 x 105 UCMSCs humaines (de préférence des cellules de passage 2 ou de passage 3) dans une fiole T75 (c’est-à-dire que la densité de semis sur les vaisseaux planaires 2D est de 8 000 cellules/cm2) pour la culture monocouche avec 15 mL de milieu de culture SF hMSC complet. Assurer un semis uniforme grâce à un mouvement en huit de la fiole. Culture à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire à 5 % de CO2 jusqu’à une confluence de 80 % à 90 %.
  3. Pour récolter, décanter le milieu de culture cellulaire et rincer les cellules avec 3 à 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) deux fois. Ensuite, ajouter 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % et incuber à 37 °C pendant 1 à 2 minutes jusqu’à ce que la plupart des cellules soient devenues rondes et se soient détachées du flacon, comme observé au microscope inversé à fond clair avec un objectif 4x. Ajouter 3 mL de milieu de culture SF hMSC pour mettre fin à la digestion.
  4. Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger conique de 15 mL et centrifugez à 179 x g pendant 5 min. Décanter le surnageant, rincer deux fois la pastille cellulaire avec du PBS et la remettre en suspension dans environ 3 à 5 ml de milieu de culture SF hMSC pour l’ensemencement sur des microporteurs dans des bioréacteurs.
    REMARQUE : Vérifiez la viabilité des cellules et assurez-vous que les cellules sont viables à >90%. Ne préparez les cellules qu’une fois que tous les travaux de préparation des bioréacteurs ont été effectués (étapes 2.1 à 3.6).
  5. Pour la culture monocouche de cellules HEK293T et de cellules Vero, inoculer 2 x 10 6-3 x 106 cellules dans chaque flacon T75 et cultiver avec du DMEM contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 10 % de sérum de veau nouveau-né (NBS), respectivement.
  6. Suivez les étapes 1.3 à 1.4 pour récolter les cellules. Remettre en suspension dans 3 à 5 mL de DMEM contenant 10 % de FBS.

2. Préparation du bioréacteur à cuve agitée avant l’ensemencement cellulaire

  1. Le jour −1, rincez abondamment le récipient en verre avec de l’eau déminéralisée (DI) courante une fois.
  2. Démontez tous les tubes en acier inoxydable et les roues de la plaque de tête, plongez-les dans de l’eau DI et sonnez avec un nettoyeur à ultrasons à 40 kHz et 60 °C pendant 1 h pour les nettoyer en profondeur.
    NOTA : Les préparations et les procédures seront les mêmes pour l’expansion de premier niveau dans le bioréacteur de 5 L et l’expansion de deuxième niveau dans le bioréacteur de 15 L. Les paramètres du bioréacteur de 15 L sont indiqués entre parenthèses. Si aucun paramètre n’est indiqué entre parenthèses, ces paramètres sont les mêmes pour les bioréacteurs de 5 L et de 15 L.
  3. Vérifiez soigneusement que tous les joints toriques sont intacts et en place, puis réinstallez les pièces démontées sur la plaque de tête conformément aux instructions du fabricant.
    REMARQUE : Remplacez tous les joints toriques usés ou déchirés avant l’assemblage si nécessaire. Des joints toriques usés compromettent l’étanchéité à l’air et, par conséquent, la stérilité du récipient.
  4. Ajouter 7 L (18 L pour le bioréacteur de 15 L) de solution de NaOH à 0,5 M dans la cuve de 5 L, et placer la plaque frontale avec les tubes assemblés sur le bord de la cuve pour immerger les tubes dans la solution de NaOH. Laissez reposer pendant 12 h ou toute la nuit pour éliminer les endotoxines des tubes et du récipient en verre.
    REMARQUE : Ne pas dépasser 7 L (18 L) car il s’agit du volume maximal du récipient en verre de 5 L (15 L). Portez un équipement de protection individuelle approprié lors de la manipulation de la solution de NaOH, car elle est corrosive.
  5. Retirez la plaque de tête et transvasez la solution de NaOH dans une bouteille à déchets appropriée. Jeter conformément aux règles de sécurité du laboratoire. Rincez abondamment le vaisseau, la plaque de tête et ses pièces avec de l’eau déminéralisée sans endotoxines ou de l’eau injectable pour éliminer les résidus alcalins.
  6. Ajouter 2 L (5 L) de PBS dans le récipient, remonter toutes les pièces et boulonner la plaque de tête au cadre métallique du récipient selon les instructions du fabricant.
  7. Installez un pack de consommables pour système fermé sur les pièces/tubes/orifices en acier inoxydable (SS) appropriés sur la plaque de tête conformément aux instructions du fabricant. Fixez toutes les pinces Robert sur les tubes, et il est recommandé de les renforcer par serrage avec des hémostatiques. Laissez l’un des tubes, avec un filtre d’aération de 0,22 μm à l’extrémité qui est connecté au condenseur, non serré.
    REMARQUE : Glissez les tubes en silicone sur les embouts sur les hémostatiques pour éviter de percer les tubes en silicone. Fixez uniquement les tubes en silicone et évitez de serrer les tubes C-flex inclus dans ce kit. Laisser un tube sur le condenseur non serré permettra de soulager la pression pendant l’autoclavage.
  8. Préparez 250 mL de solution de NaOH 0,1 M dans un flacon en verre GL 45 autoclavable de 500 mL et installez-le dans un bouchon à vis pour connecteur multiport GL 45 avec deux orifices. Connectez un tube en silicone de 180 mm de long, 0,13 po x 0,25 po (diamètre intérieur x diamètre extérieur) sur l’un des orifices situés sur la face inférieure du capuchon ; La longueur doit être suffisamment longue pour toucher le fond de la bouteille.
  9. Connectez un autre morceau de tube en silicone, d’une longueur de 500 mm plus longue que le précédent, au même orifice sur la face supérieure du bouchon, et connectez l’autre extrémité à un orifice d’alimentation goutte à goutte sur la plaque de tête du récipient de 5 L. Connectez un filtre d’aération de 0,22 μm à l’autre orifice du bouchon à vis.
  10. Effectuez un étalonnage en deux points sur la sonde de pH conformément aux instructions du fabricant. Ensuite, insérez les sondes de pH, d’oxygène dissous (OD) et de numération des cellules vivantes dans le récipient dans les orifices PG13,5 appropriés, et vissez-les fermement sur la plaque de tête.
  11. Effectuez un contrôle de l’étanchéité à l’air du récipient entièrement assemblé conformément aux instructions du fabricant. Maintenez une pression de 0,4 bar ± 0,01 bar pendant au moins 30 min. Relâchez lentement la pression une fois que le système a réussi le test. Si le test d’étanchéité à l’air échoue, recherchez soigneusement les points de fuite et renforcez l’assemblage de la cuve.
  12. Autoclaver le récipient entièrement assemblé avec le kit de consommables à 15 psi et 121 °C pendant 60 min. Après l’autoclavage, vérifiez tous les filtres d’aération pour vous assurer qu’ils sont intacts et secs. Retirez tous les hémostatiques.
    REMARQUE : Un filtre d’évent d’air humide ne filtrera pas efficacement le gaz et pourrait compromettre la stérilité du récipient pendant la culture cellulaire. Changez les filtres d’aération s’ils sont mouillés et autoclez à nouveau l’ensemble de la cuve.
  13. Transférez le récipient autoclavé dans une salle blanche et attendez qu’il refroidisse complètement à température ambiante. Insérez la sonde de température dans le tube du doigt de gant et connectez les câbles du moteur, de la sonde de pH et de la sonde d’oxygène dissous du contrôleur aux pièces respectives du récipient. Enroulez fermement le tapis chauffant autour du récipient.
  14. Desserrez les pinces Robert sur les tubes flexibles du condenseur de gaz d’échappement, du barboteur annulaire, de l’orifice d’alimentation goutte à goutte pour le NaOH et de l’orifice de recouvrement d’air. Allumez le contrôleur, connectez-vous et entrez les paramètres répertoriés dans le tableau 1 dans le système conformément aux instructions du fabricant. Ces tubes ne doivent à aucun moment être serrés pendant le processus de culture.
  15. Cliquez sur Démarrer et nommez l’expérience pour démarrer le bioréacteur. Laissez le bioréacteur fonctionner sur ces réglages pendant au moins 12 h, ou toute la nuit, pour saturer le PBS en oxygène afin d’effectuer un étalonnage en un point pour la sonde d’oxygène dissous plus tard.
  16. Calibrer la vitesse du volume de traitement des liquides de la pompe 1 et de la pompe 2 sur le contrôleur du bioréacteur. Installez un tube en silicone de 0,13 po x 0,25 po sur chaque pompe séparément, avec une extrémité plongeant dans une bouteille d’eau et l’autre extrémité du tube insérée dans un cylindre doseur.
  17. Réglez la vitesse de rotation de la pompe sur 300 tr/min et le temps pendant 1 min. Notez la quantité d’eau distribuée dans le ballon doseur pour les deux pompes. Ces numéros seront nécessaires pour les étapes suivantes.
  18. Préparez 500 mL de milieu de culture SF hMSC conformément aux instructions du fabricant et remplacez le bouchon du flacon de milieu de culture cellulaire par une fermeture jetable du récipient C-Flex EZ Top et un bouchon compatible. Effectuez le remplacement du bouchon à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique (BSC).
  19. Souder le tube de sortie de la bouteille de milieu au tube C-flex d’entrée de la bouteille de 10 g de microporteurs W01 pré-stérilisés pour MSC. Installez une section du tube sur la pompe 1 du contrôleur de bioréacteur, réglez la rotation de la pompe à 300 tr/min et pompez tout le milieu de culture de la bouteille dans la bouteille de microtransporteurs. Conservez ces microporteurs à 4 °C jusqu’à leur utilisation au jour 0.
    REMARQUE : Les microporteurs doivent être préparés le jour −1. Pour une culture en bioréacteur de 15 L, préparez quatre flacons (c.-à-d. 40 g, avec 4 x 500 mL de milieu SF) au total.

3. Ensemencement, culture et récolte des cellules dans un bioréacteur à cuve agitée de 5 L

  1. Le jour 0, effectuez un étalonnage en un point, plus précisément à 100 %, pour la sonde d’oxygène dissous sur le contrôleur du bioréacteur, conformément aux instructions du fabricant. Le bioréacteur à cuve agitée est maintenant prêt pour la culture cellulaire.
  2. Préparez une bouteille en verre de 2 L (5 L) pour la collecte des déchets, équipez-la d’un bouchon à vis pour connecteur multiport GL 45 à deux orifices, avec des tubes C-Flex de 30 mm, 0,25 po x 0,44 po connectés aux deux orifices et autoclavez pour stériliser. Soudez le tube C-flex de l’un des orifices de la bouteille de déchets au tube de récolte sur la plaque de tête de la cuve du bioréacteur à l’aide d’une soudeuse de tubes.
  3. Arrêtez temporairement le contrôle de la température, du pH et de l’oxygène dissous sur le contrôleur du bioréacteur, installez le tube en silicone fixé au tube de récolte sur la pompe péristaltique 2 dans le bon sens d’écoulement du liquide et distribuez complètement tout le PBS de la cuve dans la bouteille à déchets. Délogez le tube de la pompe, puis scellez et débranchez la bouteille à déchets.
    REMARQUE : Débloquez toujours les pinces Robert sur les tubes flexibles impliqués dans l’écoulement du liquide à chaque étape. Fixez une fois le transfert de liquide terminé avant de sceller et de déconnecter. Serrez plus près du côté de la plaque de tête. Le desserrage et le serrage doivent être effectués pour toutes les étapes suivantes, sauf indication contraire.
  4. Préparez 7 L (30 L) de milieu SF hMSC complet et remplacez chaque bouchon de bouteille d’origine par un bouchon de récipient jetable C-Flex EZ Top et un bouchon compatible. Soudez un module de filtration à usage unique à l’un des orifices du sac de rangement à usage unique de 10 L (50 L). Effectuez l’opération de remplacement des capuchons à l’intérieur d’un BSC.
  5. Filtrez et transférez le milieu de culture dans le sac de stockage, un flacon à la fois, en soudant les flacons de milieu de culture cellulaire à l’autre extrémité du filtre à capsule et en utilisant la pompe du contrôleur du bioréacteur. Désignez comme le sac d’alimentation.
  6. Soudez un orifice de sortie du sac d’alimentation au tube C-flex sur le tube d’alimentation de la plaque de tête et installez le tube de la pompe 1 sur le contrôleur du bioréacteur. Soudez l’autre orifice de sortie du sac d’alimentation au tube de purge et installez le tube de la pompe 2 sur le contrôleur du bioréacteur dans le bon sens d’écoulement du liquide.
    REMARQUE : Installez la section sur la conduite d’écoulement du fluide, qui est faite de tubes en silicone, sur la pompe pour une meilleure résistance à l’usure par rapport aux tubes C-Flex. Assurez-vous que les tubes sont installés dans le bon sens.
  7. Réglez la pompe de 1 vitesse à 300 tr/min et arrêtez la pompe après avoir distribué 1 L (5 L) de fluide du sac d’alimentation dans le récipient, en fonction de la vitesse de distribution du volume notée à l’étape 2.17. Redémarrez le contrôle de la température, du pH et de l’OD, avec les mêmes paramètres que ceux décrits à l’étape 2.14.
  8. Scellez et débranchez le tube reliant le sac d’alimentation au tube d’alimentation sur la plaque de tête. Soudez le tube C-Flex de la bouteille des microporteurs dispersés préparés à l’étape 2.18 au tube d’alimentation et pompez tout le contenu de la bouteille dans le récipient. Scellez et débranchez la bouteille vide de suspension de microporteur. Désinfectez toute la surface de la bouteille avec de l’éthanol à 75 % et placez-la dans un BSC pour l’utiliser comme bouteille de transfert de suspension cellulaire.
    REMARQUE : Laissez un morceau plus long de tube C-Flex sur le côté de la plaque de tête lors de l’étanchéité et du débranchement des accessoires jetables, car plusieurs étapes de soudage et de déconnexion seront effectuées sur le même tube dans les étapes suivantes.
  9. Assurez-vous que la température indiquée sur le contrôleur atteint un état stable de 37 °C, ce qui prend généralement environ 30 minutes, avant de procéder à la préparation des cellules de semence comme aux étapes 1.3-1.4. Remettre en suspension 2,5 x 108 CSMh dans 500 mL de milieu SF et transférer dans le flacon vide qui contenait auparavant la suspension de microporteur.
    NOTA : Les cellules de semence pour l’expansion du bioréacteur de 15 L doivent être préparées conformément à l’étape 3.21, dans le but d’inoculer 1,0 x 109 cellules dans 500 mL.
  10. Soudez le tube C-Flex de la bouteille contenant maintenant la suspension cellulaire à l’orifice d’alimentation sur la plaque de tête, et pompez tout le contenu de la bouteille dans le récipient pour initier l’inoculation cellulaire aux microtransporteurs. Fermez et débranchez la bouteille vide. Soudez à nouveau l’orifice d’alimentation du sac d’alimentation au tube d’alimentation de la plaque de tête.
  11. Ajustez les paramètres d’agitation sur le contrôleur pour permettre une agitation intermittente afin d’améliorer l’efficacité de l’inoculation des CSMh en réglant les paramètres suivants : V1 = 35 (30) tr/min/5 min ; V2 = 0 tr/min/25 min ; nombre de cycles = 12 (24) ; Vitesse d’agitation finale = 35 (30) tr/min.
    NOTA : La vitesse d’agitation peut être réglée à 40 (35) tr/min ou 45 (40) tr/min si une distribution ou une sédimentation non uniforme des microporteurs est observée pendant le processus de culture.
  12. Configurez un régime automatisé de supplément et d’échange de milieu sur le contrôleur de bioréacteur dans l’interface d’échange de milieu. Définissez les paramètres de culture hMSC comme indiqué dans le tableau 2.
    REMARQUE : Desserrez toutes les pinces Robert sur les tubes flexibles impliqués dans l’écoulement du liquide à ce stade, en particulier pour le tube d’alimentation et de purge. Gardez-les débridés tout au long du processus de culture.
  13. Prélevez les échantillons dans le tube d’échantillonnage en connectant les sacs d’échantillonnage jetables via des connecteurs Luer aux moments souhaités, généralement une fois par jour, et en aliquotant 10 ml à chaque fois dans le sac d’échantillonnage. Aliquote 2 à 3 mL d’échantillon dans le premier sac d’échantillonnage, jeter, puis aliquote les 10 mL d’échantillon réels dans un nouveau sac d’échantillonnage à chaque fois.
    REMARQUE : L’échantillon initial de 2 à 3 ml peut être laissé dans le tube à partir du point d’échantillonnage précédent et peut ne pas représenter avec précision l’état dans le récipient. Effectuez toujours ces étapes avec des mesures aseptiques supplémentaires en désinfectant les connecteurs Luer avant et après avoir effectué ou rompu des connexions avec de l’éthanol à 75 %.
  14. Transférez les échantillons prélevés dans un tube à centrifuger conique de 15 ml. Effectuez les tests suivants sur les échantillons.
    1. Prélever 200 μL de la suspension de microporteurs chargés de cellules et colorer avec Calcein-AM/PI Cell Double Coloring selon les instructions du fabricant. Observez au microscope à fluorescence.
    2. Sédimentez les microporteurs par gravitation, ce qui prend généralement 5 à 10 minutes. Aspirez le surnageant et testez la concentration de glucose à l’aide d’un glucomètre conformément aux instructions du fabricant. Tracez un graphique du taux de glucose.
    3. Incuber les microtransporteurs chargés de cellules sédimentées avec une solution de digestion à 1 mg/mL à 37 °C fraîchement préparée pendant 30 à 30 minutes pour dissoudre complètement les microtransporteurs. Comptez les cellules après coloration avec AO/PI avec un analyseur de cellules de fluorescence automatisé. Tracez une courbe de croissance cellulaire. Corrélez avec la courbe de croissance des cellules vivantes en temps réel générée sur le contrôleur.
  15. Au jour 4 ou au jour 5 de la culture, préparer 50 mL (200 mL) de solution digéré à 30 mg/mL. Le rapport de masse de travail entre la solution de digestion et les microporteurs solubles varie de 3 :20 à 5 :20. Filtrer stérilement avec un filtre à capsule de 0,22 μm, puis diluer dans 500 ml (2 L) de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) avec du calcium et du magnésium. Transférer dans un sac de rangement jetable de 3 L.
    REMARQUE : Ne préparez la solution de digestion que juste avant le prélèvement des cellules. Essayez de viser au moins 1,0 x 10 9-1,2 x 109 cellules pour l’extension de premier niveau et 1,0 x10 10 cellules pour l’extension de deuxième niveau. Si les cellules se développent plus rapidement, récoltez au jour 4 ; Si ce n’est pas le cas, récoltez au jour 5. Il n’est pas conseillé d’aller au-delà du jour 5.
  16. Réglez la vitesse d’agitation sur 0 sur le contrôleur pour que les microporteurs se déposent, ce qui se produit généralement dans les 20 minutes. Désactivez le protocole d’échange de milieu automatisé et arrêtez le contrôle de la température, du pH et de l’oxygène dissous sur le contrôleur du bioréacteur. Démarrer manuellement la pompe 2 à 300 tr/min sur le contrôleur et distribuer le surnageant dans le régime d’alimentation pour laisser environ 1 L (2 L) de suspension de culture dans le récipient (en utilisant la vitesse de distribution du volume indiquée à l’étape 2.17 ou en calibrant à partir des marques de graduation sur le corps du récipient). Scellez et débranchez totalement le sac d’alimentation.
  17. Soudez le sac de solution digestive fraîchement préparée de l’étape 3.15 au tube d’alimentation et pompez tout le contenu dans le récipient. Démarrer la vitesse d’agitation à 45 (40) tr/min. Assurez-vous que le contrôle de la température maintient toujours la température à 37 °C. Les microporteurs se dissolvent en 40 à 60 minutes. Prélever 1 mL de l’échantillon à l’aide d’une seringue stérile Luer Lock à 30 min, puis toutes les 5 à 10 min pour observer au microscope à fond clair afin de vérifier la dissolution des microporteurs.
  18. Une fois les microporteurs dissous, souder un sac de stockage de 3 L (deux sacs de stockage de 3 L pour le bioréacteur de 15 L) au tube de récolte et pomper complètement la suspension cellulaire à l’aide de la pompe 2 à 300 tr/min. Préparer 1 L (3,5 L) de solution saline contenant 1 % d’albumine sérique humaine (HSA) comme tampon de lavage et 500 mL de milieu SF complet (500 mL de tampon de cryoconservation cellulaire, une formulation de 10 % de sulfate de diméthyle (DMSO) et de milieu à 90 % de SF est pris à titre d’exemple) dans des sacs de stockage jetables séparés en utilisant les méthodes et les accessoires mentionnés aux étapes précédentes pour les autres transferts de liquide.
  19. Allumez le système de traitement des cellules, installez un kit de traitement des cellules jetables sur l’instrument conformément aux instructions du fabricant, soudez les sacs de suspension cellulaire, de tampon de lavage et de milieu SF (tampon de cryoconservation) au kit de traitement des cellules jetables, et suivez attentivement toutes les instructions affichées sur l’interface utilisateur pour initialiser et vérifier l’intégrité et la bonne installation du kit.
  20. Une fois l’installation terminée, entrez les paramètres énumérés dans le tableau 3 pour le lavage des cellules avec tampon de lavage et remise en suspension dans un milieu SF (tampon de cryoconservation) dans le logiciel pour démarrer le processus de lavage et de remise en suspension. L’ensemble de la procédure sera effectué automatiquement avec plusieurs points de contrôle manuels.
  21. Prélevez un échantillon des cellules de la chambre de centrifugation, comme indiqué par le système de traitement des cellules, et calculez la densité des cellules avec un analyseur de cellules automatisé selon les instructions du fabricant. Ajustez le volume de remise en suspension pour une densité de 2 x 106 cellules/mL ou un volume total maximal de 250 mL.
  22. Scellez et débranchez le sac de transfert de cellules du kit de traitement des cellules jetables une fois que le système a aspiré les cellules hors de la chambre. Réajustez la densité cellulaire à 2 x 106 cellules/mL avec un milieu SF complet dans un sac de transfert de cellules/sac de stockage de milieu plus grand si nécessaire. Il s’agira des cellules germées pour l’expansion de deuxième niveau dans le bioréacteur de 15 litres.

4. Formulation, remplissage et finition des cellules

  1. Commencez à préparer le bioréacteur de 15 L 1 jour avant le prélèvement des cellules du bioréacteur de 5 L. Suivez complètement les étapes des sections 2 et 3 du protocole, à l’exception des paramètres pour 15 L indiqués entre parenthèses.
  2. Remettre les cellules en suspension dans 250 mL de tampon de cryoconservation, puis sceller et déconnecter le sac de transfert cellulaire du kit de traitement des cellules jetables une fois que le système a aspiré les cellules hors de la chambre.
  3. Transférer 2 000 mL de tampon de cryoconservation avec les 250 mL de cellules remises en suspension de l’étape 4.2 dans un sac de transfert de cellules de 3 L. Soudez ce sac de transfert à un kit de consommables jetables Fill&Finish.
    NOTA : Le volume supplémentaire de tampon de cryoconservation utilisé ici doit être déterminé par la spécification de la formulation et le calcul du nombre total de cellules selon les résultats de comptage obtenus à l’étape 3.21
  4. Assemblez le kit de consommables jetables Fill&Finish au système de remplissage des cellules et allumez le système de pré-refroidissement conformément aux instructions du fabricant. Suivez les instructions sur le système et réglez pour remplir 20 ml/sac avec un total de 20 sacs par lot. Scellez et déconnectez ces sacs du kit et suivez les procédures de cryoconservation standard. Utilisez des sacs cryo-stockés.
  5. Soudez un nouvel ensemble de 20 sacs de cryoconservation au kit de consommables jetables Fill&Finish et répétez la procédure de remplissage et de finition jusqu’à ce que toutes les cellules soient aliquotes. Suivez les procédures standard pour cryoconserver ces cellules.

5. Caractérisation de la qualité cellulaire

  1. Échantillonner les CSMh récoltées à partir des microporteurs solubles et utiliser un système de traitement cellulaire pour la caractérisation par cytométrie en flux afin de déterminer l’identité cellulaire selon les méthodes décrites dans la littérature18.
  2. Décongeler les cellules cryoconservées et les replaquer sur des flacons ou des microplaques 2D conventionnels pour une caractérisation plus approfondie des caractéristiques cellulaires, y compris la morphologie cellulaire et la capacité de différenciation trillignée, selon les méthodes décrites dans la littérature18.

6. HEK293T expansion sur des microporteurs G02 dans le bioréacteur à cuve agitée

  1. Préparez un bioréacteur de 5 L comme mentionné à l’étape 2. Pour les cellules HEK293T, cultivez les cellules avec des microporteurs stériles G02 au lieu de W01. Le processus de culture est similaire à celui de la section 3 du protocole, bien que certains paramètres soient différents, comme nous le verrons dans les étapes suivantes. Installer un tube de perfusion spécial dans le bioréacteur en remplacement du tube de purge, car la perfusion est nécessaire pour la culture de HEK293T cellules.
  2. À la différence du protocole décrit à la section 3 du protocole, préparer 20 g de microporteurs G02 (c.-à-d. deux bouteilles) dans du DMEM avec 10 % de FBS pour le bioréacteur de 5 L, le volume de culture du jour 0 étant fixé à 3,5 L (c.-à-d. une concentration finale d’environ 5,71 g/L). Verser 2 L de milieu dans le récipient avant les deux flacons de microporteurs G02 et inoculer 500 mL de 1,75 x 109 HEK293T cellules (c’est-à-dire à une densité finale de 5 x 105 cellules/mL).
  3. Effectuer un régime d’agitation et un régime d’échange de milieu (en fonction de la quantité de milieu à changer par jour, exprimée en volume de culture par jour, CVD), qui est différent de la section 3 du protocole et qui est détaillé dans le tableau 4.
    REMARQUE : Activez manuellement la pompe 1 et la pompe 2 afin que les deux puissent pomper en continu pour que la perfusion se produise. Ajustez la vitesse de la pompe tous les jours pour répondre au débit de perfusion en fonction de l’étalonnage de la vitesse de distribution du volume des pompes. Habituellement, il s’agit d’une fourchette à un chiffre. Pour les cellules HEK293T, utilisez un milieu frais comme aliment et jetez totalement le milieu usagé dans une bouteille de déchets, contrairement aux CSMh, pour lesquelles le milieu est mis en circulation.
  4. Pour l’extension du deuxième niveau au bioréacteur de 15 L, utiliser le transfert bille à bille des cellules HEK293T au lieu de la dissolution complète des microporteurs comme c’est le cas pour les CSMh. Plus précisément, arrêtez l’agitation pour sédimenter les microporteurs une fois que la densité cellulaire souhaitée est atteinte, puis aspirez autant de surnageant que possible hors du tube de perfusion, alimentez le PBS avec 3 fois le volume de suspension restante pour laver les microtransporteurs, et répétez trois fois. Aspirez et jetez autant de PBS que possible lors du lavage final.
  5. Introduire 3,5 L de trypsine recombinante 1x pour détacher les cellules des microporteurs pendant que les microporteurs G02 restent intacts. Réglez la température à 37 °C et la vitesse d’agitation à 60 tr/min. Terminez le décollement dans les 45 minutes, lorsque plus de 80 % des cellules se sont détachées, avec une quantité égale de milieu complet.
  6. Transférez directement du port de récolte à un récipient de 15 L préparé pour une expansion de deuxième niveau.

7. Expansion des cellules Vero sur des microporteurs V01 dans le bioréacteur à cuve agitée

  1. Préparer les microporteurs V01 en transférant les microporteurs lyophilisés dans la cuve du bioréacteur avec le PBS à une concentration de 20 mg/mL. Assembler et stériliser le récipient comme mentionné dans la section 2 du protocole, mais en autoclave pendant 30 minutes à la place.
  2. Après la stérilisation, les microporteurs V01 se déposent naturellement. Remplacez le surnageant par le DMEM de base deux fois à l’aide des tubes de purge et d’alimentation, et ajoutez le DMEM complet contenant 10 % de NBS à 50 % à 75 % du volume du récipient avant de passer à la section 3 du protocole pour l’inoculation et la culture cellulaires.
  3. À la différence du protocole décrit à la section 3 du protocole, utiliser 24 g de microporteurs V01 pour une culture de 4 L de cellules Vero (c.-à-d. une concentration finale de 6 g/L) et inoculer 500 mL de 4 x 109 cellules Vero (c.-à-d. à une densité finale de 1 x 106 cellules/mL).
  4. Suivez les étapes 6.3 à 6.6 pour les paramètres du procédé de culture et le passage à l’expansion de deuxième niveau dans le bioréacteur à cuve agitée de 15 L.

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Résultats

La plate-forme ACISCP est un système entièrement fermé qui utilise une série de bioréacteurs à cuve agitée pour l’expansion à grande échelle, un système de traitement cellulaire pour la récolte et la formulation automatisées des cellules, et un système de remplissage cellulaire (Figure 1). Les cellules adhérentes se fixent aux microporteurs poreux, qui peuvent être dispersés dans le bioréacteur, réalisant ainsi la culture en suspension des cellules adhérentes.

Sui...

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Discussion

L’immunothérapie et la thérapie par cellules souches utilisent toutes deux des cellules vivantes comme médicaments ; Cependant, leurs produits finaux ne doivent pas être purifiés ou stérilisés de la même manière que les petites molécules ou les virus. Par conséquent, le principe de la qualité par la conception (QbD) doit toujours être gardé à l’esprit et appliqué dans la pratique au processus de fabrication et de contrôle des produits chimiques (CMC) lors de la production de cellules23. Un système...

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Déclarations de divulgation

Y.D. est conseiller scientifique, et H.X., Y.Z., L.G., M.L., Y.Y., W.L. et X.Y. sont des employés de Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd. Les autres auteurs n’ont aucun intérêt commercial, patrimonial ou financier dans les produits ou les entreprises décrits dans cet article. Tous les autres auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu financièrement par la National Science Foundation for Distinguished Young Scholars (82125018).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,25 % de trypsine EDTABasalMediaS310JVUtilisé pour la récolte de cellules 2D.
3D FloTrix DigestCytoNiche BiotechR001-500Il s’agit d’un réactif qui dissout spécifiquement les microporteurs 3D TableTrix.
Milieu sans sérum 3D FloTrix MSCCytoNiche BiotechRMZ112Il s’agit d’un milieu sans sérum et sans animaux pour l’expansion et la maintenance des cellules souches mésenchymateuses en culture planaire 2D ainsi que la culture 3D sur des microtransporteurs 3D TableTrix.
Module de filtration à usage unique 3D FloTrixCytoNiche BiotechR020-00-10Ce module contient 0,22 &mu ; Filtres à capsules M utilisés pour la filtration du milieu de culture et de la solution de digestion.
Sac de rangement à usage unique 3D FloTrix (10 L)CytoNiche BiotechR020-00-03Utilisé comme sac d’alimentation pour le bioréacteur de 5 L.
Sac de conservation à usage unique 3D FloTrix (3 L)CytoNiche BiotechR020-00-01Utilisé comme sacs d’ensemencement ou de transfert de cellules.
Sac de rangement à usage unique 3D FloTrix (50 L)CytoNiche BiotechR020-00-04Utilisé comme sac d’alimentation pour le bioréacteur de 15 L.
3D FloTrix vivaPACK Remplissage jetable& Kit de Consommables de FinitionCytoNiche BiotechPACK-01-01Il s’agit d’un kit standard adapté au système de remplissage et de finition 3D vivaPACK.
Système de remplissage et de finition 3D FloTrix vivaPACK pour cellulesCytoNiche BiotechvivaPACKCe système est un dispositif fermé de manipulation de liquides, avec des fonctions automatisées de mélange et d’évacuation des gaz. Les cellules remises en suspension dans un tampon de cryoconservation peuvent être rapidement et uniformément alibuées dans 20 sacs par lot.
Système de traitement cellulaire 3D FloTrix vivaPREP PLUSCytoNiche BiotechvivaPREP PLUSCe système est un dispositif basé sur une centrifugeuse à flux continu. Les cellules peuvent être concentrées, lavées et remises en suspension dans le cadre de procédures complètement fermées.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing KitCytoNiche BiotechPREP-PLUS-00Il s’agit d’un kit standard adapté au traitement cellulaire 3D vivaPREP PLUS.
Bioréacteur 3D FloTrix vivaSPIN  ; 15 LCytoNiche BiotechFTVS15Ce bioréacteur utilise un contrôleur, une cuve à cuve agitée en verre de 15 L et des assesseurs. Un tube de perfusion spécial est disponible.
Bioréacteur 3D FloTrix vivaSPIN  ; 5 LCytoNiche BiotechFTVS05Ce bioréacteur utilise un contrôleur, une cuve en verre de 5 L et des assesseurs. Un tube de perfusion spécial est disponible.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L)CytoNiche BiotechR020-10-10Il s’agit d’un kit de tubulure standard adapté au bioréacteur 3D vivaSPIN 15 L, contenant des sacs de prélèvement.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L)CytoNiche BiotechR020-05-10Il s’agit d’un kit de tubulure standard adapté au bioréacteur 3D vivaSPIN 5 L, contenant des sacs de prélèvement.
3D TableMicrocarriers Trix G02CytoNiche BiotechG02-10-10gCes microsupports poreux et dégradables sont adaptés à la culture cellulaire HEK293T. Ils sont pré-stérilisés en 10 g/bouteille avec des tubes C-Flex pour le soudage sur des tubes sur des bioréacteurs.
3D TableMicrocarriers Trix V01CytoNiche BiotechV01-100-10gCes microsupports poreux et dégradables conviennent à la culture cellulaire adhérente, ils se présentent sous forme de microsupports non stérilisés qui doivent être autoclavés dans du PBS avant d’être utilisés. Ils sont particulièrement adaptés à la production de vaccins.
3D TableTrix microcarriers W01CytoNiche BiotechW01-10-10g (emballage à usage unique) ;
W01-200 (comprimés)		Ces microsupports poreux et dégradables conviennent à la culture cellulaire adhérente, en particulier aux cellules qui doivent être récoltées comme produits finis. Ils sont pré-stérilisés en 10 g/bouteille avec des tubes C-Flex pour le soudage sur des tubes sur des bioréacteurs. Le produit a obtenu 2 qualifications pour les excipients pharmaceutiques de la CDE, avec les numéros d’enregistrement de [F20200000496 ; F20210000003]. Il a également reçu la qualification DMF pour les excipients pharmaceutiques de la FDA, avec le numéro d’enregistrement de [DMF :35481]
APC anti-human CD45 AntibodyBioLegend368512Utilisé en cytométrie en flux pour l’évaluation de l’identité MSC
Calcein-AM/PI Double Staining KitDojindoC542Le kit de double coloration Calcein-AM/PI est utilisé pour la coloration par fluorescence simultanée des cellules viables et mortes. Ce kit contient des solutions de Calcein-AM et d’iodure de propidium (PI), qui colorent respectivement les cellules viables et mortes.
Bouchon pour EZ Top Fermetures de récipients pour récipients NALGENE (500mL)Saint-GobainCAP-38Les marques et les numéros de catalogue ne sont que par exemple, des produits similaires sont disponibles auprès de différents fournisseurs et tant qu’ils ont la même fonctionnalité, les articles peuvent être remplacés par d’autres marques.
Tube C-Flex, Formulation 374 (0,25 po x 0,44 po)Saint-Gobain374-250-3Utilisé pour le soudage et la déconnexion des tubes.
Sac de congélation CryoMACS 50Miltenyi Biotec  ;200-074-400Utilisé pour l’extension du 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill& Kit de consommables de finition.
Sulfate de diméthyle (DMSO)  ;SigmaD2650-100mLUtilisé pour la préparation de la solution de cryoconservation.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)BasalMediaL120KJUtilisé pour la culture de cellules HEK293T et Vero.
DURAN Original GL 45 Bouteille de laboratoire (2 L)DWK life sciences218016357Utilisée pour la collecte des déchets du bioréacteur de 5 L.
DURAN Original GL 45 Bouteille de laboratoire (5 L)DWK life sciences218017353Utilisée pour la collecte des déchets du bioréacteur de 15 L.
DURAN Original GL 45 Flacon de laboratoire (500 mL)DWK life sciences218014459Utilisé pour flacon supplémentaire de 0,1 M NaOH.
Fermetures de récipients EZ Top pour conteneurs NALGENE (500mL)Saint-GobainEZ500 ML-38-2Les marques et les numéros de catalogue ne sont que par exemple, des produits similaires sont disponibles auprès de différents fournisseurs et tant qu’ils ont les mêmes fonctionnalités, les articles peuvent être remplacés par d’autres marques.
Sérum fœtal bovin (FBS) de qualité supérieureWisent086-150Utilisé pour la culture de cellules HEK293T.
Anticorps anti-CD14 humain FITCBioLegend301804Utilisé en cytométrie en flux pour l’évaluation de l’identité des CSM.
L’anticorps anti-CD34 humain FITCBioLegend343504utilisé en cytométrie en flux pour l’évaluation de l’identité des CSM.
L’anticorps anti-CD90 humain (Thy1) FITCBioLegend328108utilisé en cytométrie en flux pour l’évaluation de l’identité des CSM.
Cytométrie en fluxBeckman CoulterCytoFLEXUtilisé pour l’évaluation de l’identité cellulaire.
Analyseur de cellules à fluorescenceAlit life scienceCountstar Rigel S2Utilisé pour le comptage cellulaire. La viabilité cellulaire peut être calculée par coloration avec des colorants AO/PI.
GL 45 Connecteur multiport Bouchon à vis avec 2 ports  ;Lesmarques et les numéros de catalogue ne sont que des produits similaires 292632806 différents fournisseurs et, tant qu’ils ont les mêmes fonctionnalités, les articles peuvent être remplacés par d’autres marques.
GlucomètreSinocare6243578Utilisé pour détecter la concentration de glucose dans le milieu de culture cellulaire et le surnageant.
La solution saline équilibrée de Hank (HBSS), avec du calcium et du magnésiumGibco14025092Utilisée pour la préparation de la solution de digestion.
Albumine humaine 20 % Behring (HSA)CSL BehringN/AUtilisé pour la préparation du tampon de lavage.
Microscope à fluorescence inverséeOLYMBUSCKX53SFUtilisé pour l’observation et l’imagerie de champ de fluorescence et de fluorescence.
Cylindre doseur Nalgene (500 mL)Thermo Scientific3662-0500PKUtilisé pour calibrer la vitesse volumique de manipulation des liquides des pompes péristaltiques.
Sérum de veau nouveau-né (NBS) superfinMINHAI BIOSC101.02Utilisé pour la culture des cellules Vero.
Kit de différenciation et de caractérisation adipogénique des cellules souches mésenchymateuses humainesOriCell CyagenHUXUC-90031Utilisé pour la différenciation tri-lignée des hUCMSCs.
Kit de différenciation et de caractérisation chondrogénique des cellules souches mésenchymateuses humainesOriCell CyagenHUXUC-90041Utilisé pour la différenciation tri-lignées des hUCMSCs.
Kit de différenciation et de caractérisation ostéogénique des cellules souches mésenchymateuses humainesOriCell CyagenHUXUC-90021Utilisé pour la différenciation tri-lignée des hUCMSCs.
L’anticorps PE anti-humain CD105BioLegend800504utilisé en cytométrie en flux pour l’évaluation de l’identité des CSM.
Anticorps PE anti-CD19 humainBioLegend302208Utilisé en cytométrie en flux pour l’évaluation de l’identité des CSM.
Anticorps CD73 (Ecto-5'-nucléotidase) humainPE BioLegend344004utilisé en cytométrie en flux pour l’évaluation de l’identité des CSM.
Anticorps HLA-DR humain anti-PEBioLegend307605Utilisé en cytométrie en flux pour l’évaluation de l’identité des CSM.
Saline tamponnée au phosphate (PBS)Wisent311-010-CLUtilisé dans l’autoclave des récipients en verre et des microsupports V01, et le remplacement du milieu de culture.
Tube sanitaire en silicone durci au platine Sani-Tech (0,13 po x 0,25 po)Saint-GobainULTRA-C-125-2FUtilisé pour le transfert de solution entraîné par des pompes péristaltiques.
Saline stérileHopebiolHBPP008-500Utilisé pour la préparation du tampon de lavage.
Trypzyme Recombinant TrypsinBasalMediaS342JVCe réactif est utilisé pour le transfert de bille à bille des cellules HEK293T et Vero.
Scelleuse de tubesYingqi BiotechScelleuse de tubes ICette scelleuse est compatible avec les tubes C-Flex et les tubes en PVC.
Soudeuse de tubes pour tubes en PVCSoudeuse de tubes ChuBiotechUtilisé pour le soudage de tubes en PVC.
Soudeuse de tubes pour tubes TPEYingqi BiotechI-V2Utilisée pour le soudage de tubes TPE.
LaNexcelomCS2-0106-25mL, utilisant de l’orange acridine (AO) et de l’iodure de propidium (PI), est la méthode recommandée pour une analyse précise de la viabilité des cellules primaires, telles que les PBMC, et des cellules souches dans les échantillons contenant des débris.
Micro I Soudeuse de tubes viabilité à double fluorescence

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