Produção de células em larga escala com base em microtransportadores porosos solúveis de grau GMP

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para alcançar a fabricação em larga escala de células aderentes através de um sistema totalmente fechado baseado em microcarreadores dissolvidos grau GMP. O cultivo de células-tronco mesenquimais humanas, células HEK293T e células Vero foi validado e atendeu tanto às exigências de quantidade quanto aos critérios de qualidade para a indústria de terapia celular e gênica.

Abstract

Pesquisadores da indústria de terapia celular e gênica (CGT) há muito enfrentam um desafio formidável na expansão eficiente e em larga escala das células. Para resolver as deficiências primárias do sistema de cultura planar bidimensional (2D), desenvolvemos de forma inovadora uma plataforma automatizada de produção de células em escala industrial fechada (ACISCP) baseada em um microtransportador poroso, solúvel e de grau GMP para a cultura 3D de células aderentes, incluindo células-tronco mesenquimais/estromais humanas (hMSCs), células HEK293T e células Vero. Para alcançar a expansão em larga escala, uma expansão de dois estágios foi conduzida com biorreatores de tanque agitado de 5 L e 15 L para produzir 1,1 x^{10 10} hMSCs com uma expansão geral de 128 vezes em 9 dias. As células foram colhidas por dissolução completa dos microcarreadores, concentradas, lavadas e formuladas com um sistema de processamento celular baseado em centrífuga de fluxo contínuo e, em seguida, aliquotadas com um sistema de enchimento celular. Em comparação com a cultura planar 2D, não há diferenças significativas na qualidade das hMSCs colhidas da cultura 3D. Também aplicamos esses microcarreadores porosos solúveis a outros tipos de células populares no setor CGT; especificamente, células HEK293T e células Vero foram cultivadas até densidades celulares máximas de 1,68 x 10 7 células/mL e 1,08 x 10⁷ células/mL, respectivamente. Este estudo fornece um protocolo para o uso de uma plataforma de engenharia de bioprocessos que aproveita as características de microtransportadores dissolvidos de grau GMP e equipamentos fechados avançados para alcançar a fabricação em escala industrial de células aderentes.

Introduction

A indústria de CGT testemunhou uma expansão exponencial nas últimas duas décadas. Espera-se que a evolução dos medicamentos de última geração tratem e cure inúmeras doenças refratárias¹. Desde a primeira aprovação da Food and Drug Administration (FDA) de um produto CGT, Kymriah, em 2017, a pesquisa e o desenvolvimento relacionados à CGT no mundo continuaram a crescer em um ritmo rápido, com a FDA vendo os pedidos de novos medicamentos experimentais ativos para CGT aumentarem para 500 em 2018². Previa-se que o número de aprovações de produtos CGT provavelmente seria de 54-74 nos Estados Unidos até 2030².

Embora o rápido crescimento na pesquisa e inovação da CGT seja empolgante, ainda há uma grande lacuna tecnológica entre a pesquisa em laboratório e a fabricação em escala industrial que poderia fornecer esses medicamentos promissores para alcançar quantos pacientes forem necessários a custos acessíveis. Os processos atuais adotados para esses ensaios clínicos foram estabelecidos em laboratórios para experimentos em pequena escala, e esforços significativos são necessários para melhorar e inovar na fabricação de CGT³. Existem muitos tipos de produtos CGT, a maioria deles baseados em células vivas, que podem ser alogênicos, autólogos, engenheirados ou naturais. Esses fármacos vivos são muito mais complexos do que pequenas entidades moleculares ou biológicos, tornando a fabricação em larga escala um desafio significativo ^4,5,6. Neste trabalho, demonstramos um protocolo de produção celular em larga escala para três células dependentes de ancoragem que são amplamente aplicadas em TCGs. Estes incluem células-tronco mesenquimais/estromais humanas (hMSCs), que têm sido usadas para terapia baseada em células, e células HEK293T e células Vero, ambas usadas para produzir vírus para a engenharia genética do produto celular terapêutico final. Células dependentes de ancoragem são comumente cultivadas em sistemas planares, que requerem processamento manual. No entanto, os métodos de cultura manual requerem uma quantidade significativa de mão de obra e são propensos à contaminação, o que pode comprometer a qualidade do produto final. Além disso, não há controle de processo em linha, levando a uma variabilidade substancial na qualidade entre os lotes⁷. Tomando como exemplo a terapia com células-tronco, com um pipeline promissor de mais de 200 candidatos à terapia com células-tronco, estima-se que seriam necessários 300 trilhões de hMSCs por ano para atender às demandas de aplicações clínicas⁸. Assim, a fabricação em larga escala de células terapêuticas tornou-se um pré-requisito para a realização dessas intervenções terapêuticas com uma demanda celular tão^alta9.

Para evitar os contratempos dos sistemas planares, esforços têm sido feitos no desenvolvimento de processos de fabricação em larga escala em biorreatores de tanque agitado com microcarreadores convencionais não solúveis 10,11,12,13^, mas estes sofrem com procedimentos de preparação complicados e baixa eficiência de colheita de células ¹⁴. Recentemente, inovamos um microcarreador solúvel para expansão de células-tronco, com o objetivo de contornar os desafios da colheita de células de microcarreadores comerciais convencionais não solúveis¹⁵. Este novo microtransportador poroso solúvel 3D de grau GMP, disponível comercialmente, 3D TableTrix, mostrou grande potencial para a produção de células em larga escala. De fato, a cultura 3D baseada nesses microcarreadores porosos poderia potencialmente recriar microambientes biomiméticos favoráveis para promover adesão, proliferação, migração e ativação celular¹⁶. As estruturas porosas e as redes de poros interconectadas dos microcarreadores poderiam criar uma maior área de adesão celular e promover a troca de oxigênio, nutrientes e metabólitos, criando assim um substrato ótimo para a expansão celular in vitro ¹⁷. A alta porosidade desses microcarreadores porosos solúveis 3D grau GMP permite a expansão em larga escala das hMSCs, e a capacidade de as células serem totalmente dissolvidas permite a colheita eficiente dessas células expandidas¹⁸. É também um produto de grau GMP e foi registrado como excipiente farmacêutico no Centro Chinês de Avaliação de Medicamentos (números de depósito: F20210000003 e F20200000496)¹⁹ e no FDA dos Estados Unidos (FDA, EUA; Número do arquivo mestre de drogas: 35481)²⁰.

Aqui, ilustramos um sistema automatizado de produção de células em escala industrial fechada (ACISCP)¹⁸ usando esses microcarreadores porosos dispersíveis e solúveis para hMSC, célula HEK293T e expansão de células Vero. Conseguimos uma expansão bem-sucedida de duas camadas de hMSCs (expansão cumulativa de 128 vezes em 9 dias) de um biorreator de 5 L para um biorreator de 15 L e, finalmente, obtivemos até 1,1 x 10¹⁰ hMSCs de um único lote de produção. As células foram colhidas por dissolução completa dos microcarreadores, concentradas, lavadas e formuladas com um sistema de processamento de células baseado em centrífuga de fluxo contínuo e, em seguida, aliquotadas com um sistema de enchimento celular. Além disso, avaliamos a qualidade dos produtos hMSC para confirmar a conformidade. Também demonstramos a aplicação desses microcarreadores solúveis para a produção em escala de dois outros tipos de células de ancoragem, células HEK293T e células Vero, que são extensivamente aplicadas na indústria CGT. O pico de densidade celular das células HEK293T atingiu 1,68 x 10 7 células/mL, enquanto o pico de densidade das células Vero atingiu 1,08 x 10⁷ células/mL. O sistema ACISCP poderia ser adaptado para cultivar uma variedade de células aderentes, e poderia potencialmente se tornar uma plataforma poderosa contribuindo para acelerar a industrialização da CGT.

Protocol

O cordão umbilical humano foi obtido do Hospital Beijing Tsinghua Changgeng. Todos os procedimentos e protocolos referentes à aquisição, isolamento e cultura de células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano (CTMSCs) foram conduzidos com consentimento informado e com a aprovação do Comitê de Ética do Beijing Tsinghua Changgeng Hospital (processo número 22035-4-02), e os procedimentos e protocolos cumpriram a declaração de Helsinque de 1964 e suas alterações posteriores ou padrões éticos comparáv…

Representative Results

A plataforma ACISCP é um sistema totalmente fechado que emprega uma série de biorreatores de tanque agitado para expansão em escala, um sistema de processamento de células para colheita e formulação automatizada de células e um sistema de enchimento de células (Figura 1). As células aderentes ligam-se aos microcarreadores porosos, que podem ser dispersos no biorreator, conseguindo, assim, o cultivo em suspensão das células aderentes. Seguindo o protocol…

Discussion

Tanto a imunoterapia quanto a terapia com células-tronco utilizam células vivas como drogas; No entanto, seus produtos finais não devem ser purificados ou esterilizados da mesma forma que pequenas moléculas ou vírus. Portanto, o princípio do Quality by Design (QbD) deve ser sempre lembrado e aplicado na prática ao processo de Fabricação e Controle Químico (CMC) durante a produção de células²³. Um sistema de cultura de células totalmente fechado, bem como um sistema de processamento e…

Materials

0.25% trypsin EDTA	BasalMedia	S310JV	Used for 2D cell harvest.
3D FloTrix Digest	CytoNiche Biotech	R001-500	This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix MSC Serum Free Medium	CytoNiche Biotech	RMZ112	This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix Single-Use Filtration Module	CytoNiche Biotech	R020-00-10	This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-03	Used as feed bag for 5 L bioreactor.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-01	Used as cell seeding or transfer bags.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-04	Used as feed bag for 15 L bioreactor.
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit	CytoNiche Biotech	PACK-01-01	This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells	CytoNiche Biotech	vivaPACK	This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system	CytoNiche Biotech	vivaPREP PLUS	This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit	CytoNiche Biotech	PREP-PLUS-00	This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 15 L	CytoNiche Biotech	FTVS15	This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 5 L	CytoNiche Biotech	FTVS05	This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L)	CytoNiche Biotech	R020-10-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L)	CytoNiche Biotech	R020-05-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.
3D TableTrix microcarriers G02	CytoNiche Biotech	G02-10-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.
3D TableTrix microcarriers V01	CytoNiche Biotech	V01-100-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.
3D TableTrix microcarriers W01	CytoNiche Biotech	W01-10-10g (single-use packaging); W01-200 (tablets)	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]
APC anti-human CD45 Antibody	BioLegend	368512	Used in flow cytometry for MSC identity assessment
Calcein-AM/PI Double Staining Kit	Dojindo	C542	Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	CAP-38	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in)	Saint-Gobain	374-250-3	Used for tube welding and disconnection.
CryoMACS Freezing Bag 50	Miltenyi Biotec	200-074-400	Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit.
Dimethyl Sulfate (DMSO)	Sigma	D2650-100mL	Used for preparation of cryopreservation solution.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	BasalMedia	L120KJ	Used for cultivation of HEK293T and Vero cells.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L)	DWK life sciences	218016357	Used for waste collection from the 5 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L)	DWK life sciences	218017353	Used for waste collection from the 15 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL)	DWK life sciences	218014459	Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.
EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	EZ500 ML-38-2	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Fetal bovine serum (FBS) superior quality	Wisent	086-150	Used for cultivation of HEK293T cells.
FITC anti-human CD14 Antibody	BioLegend	301804	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD34 Antibody	BioLegend	343504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody	BioLegend	328108	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Flow cytometry	Beckman Coulter	CytoFLEX	Used for cell identity assessment.
Fluorescence Cell Analyzer	Alit life science	Countstar Rigel S2	Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.
GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports	DWK life sciences	292632806	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Glucose Meter	Sinocare	6243578	Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium	Gibco	14025092	Used for preparation of digest solution.
Human Albumin 20% Behring (HSA)	CSL Behring	N/A	Used for preparation of wash buffer.
Inverted fluorescent microscope	OLYMBUS	CKX53SF	Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging.
Nalgene Measuring Cylinder (500 mL)	Thermo Scientific	3662-0500PK	Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.
Newborn calf serum (NBS) superfine	MINHAI BIO	SC101.02	Used for cultivation of Vero cells.
OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90031	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90041	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90021	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
PE anti-human CD105 Antibody	BioLegend	800504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD19 Antibody	BioLegend	302208	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344004	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human HLA-DR Antibody	BioLegend	307605	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Wisent	311-010-CL	Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.
Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in)	Saint-Gobain	ULTRA-C-125-2F	Used for solution transfering driven by peristaltic pumps.
Sterile Saline	Hopebiol	HBPP008-500	Used for preparation of wash buffer.
Trypzyme Recombinant Trypsin	BasalMedia	S342JV	This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.
Tube Sealer	Yingqi Biotech	Tube Sealer I	This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.
Tube Welder for PVC tubing	Chu Biotech	Tube Welder Micro I	Used for welding of PVC tubing.
Tube Welder for TPE tubing	Yingqi Biotech	Tube Welder I-V2	Used for welding of TPE tubing.
ViaStain AO / PI Viability Stains	Nexcelom	CS2-0106-25mL	Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.