GMP Sınıfı Çözünebilir Gözenekli Mikro Taşıyıcılara Dayalı Büyük Ölçekli Hücre Üretimi

Summary

Burada, GMP sınıfı çözünebilir mikro taşıyıcılara dayanan tamamen kapalı bir sistem aracılığıyla yapışık hücrelerin büyük ölçekli üretimini gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz. İnsan mezenkimal kök hücrelerinin, HEK293T hücrelerinin ve Vero hücrelerinin yetiştirilmesi doğrulandı ve hücre ve gen terapisi endüstrisi için hem miktar taleplerini hem de kalite kriterlerini karşıladı.

Abstract

Hücre ve gen terapisi (CGT) endüstrisindeki araştırmacılar, hücrelerin verimli ve büyük ölçekli genişlemesinde uzun süredir zorlu bir zorlukla karşı karşıya kaldılar. İki boyutlu (2D) düzlemsel kültür sisteminin birincil eksikliklerini gidermek için, insan mezenkimal kök/stromal hücreler (hMSC’ler), HEK293T hücreleri ve Vero hücreleri dahil olmak üzere yapışık hücrelerin 3D kültürü için GMP dereceli, çözünebilir ve gözenekli bir mikro taşıyıcıya dayalı otomatik bir kapalı endüstriyel ölçekli hücre üretimi (ACISCP) platformu geliştirdik. Büyük ölçekli genişleme elde etmek için, 9 gün içinde toplam 128 kat genişleme ile 1,1 x 10 10 hMSC elde etmek için 5 L ve¹⁵ L karıştırılmış tank biyoreaktörleri ile iki aşamalı bir genişleme gerçekleştirildi. Hücreler, mikro taşıyıcıların tamamen çözülmesiyle toplandı, konsantre edildi, yıkandı ve sürekli akışlı santrifüj tabanlı bir hücre işleme sistemi ile formüle edildi ve daha sonra bir hücre doldurma sistemi ile birleştirildi. 2D düzlemsel kültürle karşılaştırıldığında, 3D kültürden hasat edilen hMSC’lerin kalitesinde önemli bir fark yoktur. Bu çözünebilir gözenekli mikro taşıyıcıları CGT sektöründeki diğer popüler hücre tiplerine de uyguladık; spesifik olarak, HEK293T hücreleri ve Vero hücreleri, sırasıyla 1.68 x 10 7 hücre / mL ve 1.08 x 10⁷ hücre / mL’lik pik hücre yoğunluklarına kadar ekilmiştir. Bu çalışma, yapışık hücrelerin endüstriyel ölçekte üretimini sağlamak için GMP sınıfı çözünebilir mikro taşıyıcıların ve gelişmiş kapalı ekipmanın özelliklerinden yararlanan bir biyoproses mühendisliği platformunun kullanılması için bir protokol sağlar.

Introduction

CGT endüstrisi son yirmi yılda üstel bir genişlemeye tanık oldu. Yeni nesil ilaçların evriminin çok sayıda refrakter hastalığı tedavi etmesi ve iyileştirmesi bekleniyor¹. 2017 yılında bir CGT ürünü olan Kymriah’ın ilk Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) onayından bu yana, FDA’nın CGT için aktif araştırma amaçlı yeni ilaç başvurularının 2018’de 500’e yükseldiğini görmesiyle, dünyada CGT ile ilgili araştırma ve geliştirme hızlı bir şekilde büyümeye devam etti². CGT ürünlerinin onay sayısının 2030 yılına kadar Amerika Birleşik Devletleri’nde muhtemelen 54-74 olacağı tahmin edilmişti².

CGT araştırma ve inovasyonundaki hızlı büyüme heyecan verici olsa da, laboratuvar araştırmaları ile endüstriyel ölçekli üretim arasında, bu umut verici ilaçları uygun maliyetlerle ihtiyaç duyulduğu kadar hastaya ulaştırabilecek büyük bir teknolojik boşluk var. Bu klinik deneyler için benimsenen mevcut süreçler, küçük ölçekli deneyler için laboratuvarlarda oluşturulmuştur ve CGT üretimini geliştirmek ve yenilik yapmak için önemli çabalara ihtiyaç vardır³. Çoğu allojenik, otolog, mühendislik ürünü veya doğal olabilen canlı hücrelere dayanan birçok CGT ürünü türü vardır. Bu canlı ilaçlar, küçük moleküler varlıklardan veya biyolojiklerden çok daha karmaşıktır, bu nedenle büyük ölçekli üretimi önemli bir zorluk haline getirir ^4,5,6. Bu çalışmada, CGT’lerde yaygın olarak uygulanan üç ankraj bağımlı hücre için büyük ölçekli bir hücre üretim protokolü gösteriyoruz. Bunlar, hücre bazlı tedavi için kullanılan insan mezenkimal kök / stromal hücrelerini (hMSC’ler) ve her ikisi de nihai terapötik hücre ürününün genetik mühendisliği için virüs üretmek için kullanılan HEK293T hücreleri ve Vero hücrelerini içerir. Ankraja bağımlı hücreler genellikle manuel işleme gerektiren düzlemsel sistemlerde kültürlenir. Bununla birlikte, manuel kültür yöntemleri önemli miktarda işçilik gerektirir ve son ürünün kalitesini tehlikeye atabilecek kontaminasyona eğilimlidir. Ayrıca, hat içi proses kontrolü yoktur, bu da partiler arasında kalitede önemli değişkenliklere yol açar⁷. Örnek olarak kök hücre tedavisini ele alırsak, 200’den fazla kök hücre tedavisi adayından oluşan umut verici bir boru hattı ile, klinik uygulamaların taleplerini karşılamak için yılda 300 trilyon hMSC’ye ihtiyaç duyulacağı tahmin edilmektedir⁸. Bu nedenle, terapötik hücrelerin büyük ölçekli üretimi, bu terapötik müdahaleleri bu kadar yüksek hücre talebiyle gerçekleştirmek için bir ön koşul haline gelmiştir⁹.

Düzlemsel sistemlerin aksaklıklarını önlemek için, geleneksel çözünmeyen mikro taşıyıcılara^{sahip karıştırılmış} tank biyoreaktörlerinde büyük ölçekli üretim süreçlerinin geliştirilmesine yönelik çabalar sarf edilmiştir 10,11,12,13^, ancak bunlar karmaşık hazırlama prosedürlerinden ve düşük hücre toplama verimliliğinden muzdariptir ¹⁴. Son zamanlarda, kök hücre genişlemesi için çözünebilir bir mikro taşıyıcı geliştirdik ve geleneksel çözünmeyen ticari mikro taşıyıcılardan hücre toplamanın zorluklarını aşmayı amaçladık¹⁵. Bu yeni, ticari olarak temin edilebilen GMP sınıfı 3D çözünebilir gözenekli mikro taşıyıcı, 3D TableTrix, büyük ölçekli hücre üretimi için büyük bir potansiyel göstermiştir. Gerçekten de, bu gözenekli mikro taşıyıcılara dayanan 3D kültür, hücre yapışmasını, çoğalmasını, göçünü ve aktivasyonunu teşvik etmek için potansiyel olarak uygun biyomimetik mikro ortamları yeniden yaratabilir¹⁶. Mikro taşıyıcıların gözenekli yapıları ve birbirine bağlı gözenek ağları, daha büyük bir hücre yapışma alanı oluşturabilir ve oksijen, besin ve metabolitlerin değişimini teşvik edebilir, böylece in vitro hücre genişlemesi için optimal bir substrat oluşturabilir¹⁷. Bu GMP sınıfı 3D çözünebilir gözenekli mikro taşıyıcıların yüksek gözenekliliği, hMSC’lerin büyük ölçekli genişlemesini sağlar ve hücrelerin tamamen çözünme yeteneği, bu genişlemiş hücrelerin verimli bir şekilde toplanmasına izin verir¹⁸. Aynı zamanda GMP sınıfı bir üründür ve Çin İlaç Değerlendirme Merkezi (dosyalama numaraları: F20210000003 ve F20200000496)¹⁹ ve Amerika Birleşik Devletleri FDA’sı (FDA, ABD; İlaç Ana Dosya numarası: 35481)²⁰.

Burada, hMSC, HEK293T hücresi ve Vero hücre genişlemesi için bu dağılabilir ve çözünebilir gözenekli mikro taşıyıcıları kullanan otomatik bir kapalı endüstriyel ölçekli hücre üretimi (ACISCP) sistemini¹⁸ gösteriyoruz. 5 L’lik bir biyoreaktörden 15 L’lik bir biyoreaktöre hMSC’lerin başarılı bir şekilde iki katmanlı genişlemesini (9 günde 128 kümülatif kat genişlemesi) elde ettik ve son olarak tek bir üretim partisinden 1,1 x 10¹⁰ hMSC’ye kadar elde ettik. Hücreler, mikro taşıyıcıların tamamen çözülmesiyle hasat edildi, konsantre edildi, yıkandı ve sürekli akış santrifüj tabanlı hücre işleme sistemi ile formüle edildi ve daha sonra bir hücre doldurma sistemi ile aliquote edildi. Ayrıca, uygunluğu doğrulamak için hMSC ürünlerinin kalitesini değerlendirdik. Ayrıca, CGT endüstrisinde yaygın olarak uygulanan diğer iki ankraj hücresi türü olan HEK293T hücreleri ve Vero hücrelerinin ölçeklendirilmiş üretimi için bu çözünebilir mikro taşıyıcıların uygulanmasını da gösterdik. HEK293T hücrelerinin pik hücre yoğunluğu 1.68 x 10 7 hücre/mL’ye ulaşırken, Vero hücrelerinin pik yoğunluğu 1.08 x 10⁷ hücre/mL’ye ulaştı. ACISCP sistemi, çeşitli yapışık hücrelerin kültürüne uyarlanabilir ve potansiyel olarak CGT’nin sanayileşmesini hızlandırmaya katkıda bulunan güçlü bir platform haline gelebilir.

Protocol

İnsan göbek kordonu Pekin Tsinghua Changgeng Hastanesi’nden alındı. İnsan göbek kordonu mezenkimal kök hücrelerinin (UCMSC’ler) edinimi, izolasyonu ve kültürü ile ilgili tüm prosedürler ve protokoller, bilgilendirilmiş onam ve Pekin Tsinghua Changgeng Hastanesi Etik Komitesi’nin (dosya numarası 22035-4-02) onayı ile yürütülmüştür ve prosedürler ve protokoller 1964 Helsinki deklarasyonu ve daha sonraki değişiklikleri veya karşılaştırılabilir etik standartlara uygundur. <p class="jove_titl…

Representative Results

ACISCP platformu, ölçek büyütme genişlemesi için bir dizi karıştırılmış tank biyoreaktörü, otomatik hücre toplama ve formülasyonu için bir hücre işleme sistemi ve bir hücre doldurma sistemi kullanan tamamen kapalı bir sistemdir (Şekil 1). Yapışık hücreler, biyoreaktöre dağılabilen gözenekli mikro taşıyıcılara bağlanır ve böylece yapışık hücrelerin askıya alınmış ekimini sağlar. Tarif edildiği gibi protokolü takiben, …

Discussion

Hem immünoterapi hem de kök hücre tedavisi, canlı hücreleri ilaç olarak kullanır; Bununla birlikte, nihai ürünleri, küçük moleküller veya virüslerle aynı şekilde saflaştırılmamalı veya sterilize edilmemelidir. Bu nedenle, Tasarımla Kalite (QbD) ilkesi her zaman akılda tutulmalı ve hücre üretimi sırasında Kimyasal Üretim ve Kontrol (CMC) sürecine pratik olarak uygulanmalıdır²³. Tamamen kapalı bir hücre kültürü sisteminin yanı sıra bir işleme sistemi ve bir dol…

Materials

0.25% trypsin EDTA	BasalMedia	S310JV	Used for 2D cell harvest.
3D FloTrix Digest	CytoNiche Biotech	R001-500	This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix MSC Serum Free Medium	CytoNiche Biotech	RMZ112	This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix Single-Use Filtration Module	CytoNiche Biotech	R020-00-10	This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-03	Used as feed bag for 5 L bioreactor.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-01	Used as cell seeding or transfer bags.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-04	Used as feed bag for 15 L bioreactor.
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit	CytoNiche Biotech	PACK-01-01	This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells	CytoNiche Biotech	vivaPACK	This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system	CytoNiche Biotech	vivaPREP PLUS	This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit	CytoNiche Biotech	PREP-PLUS-00	This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 15 L	CytoNiche Biotech	FTVS15	This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 5 L	CytoNiche Biotech	FTVS05	This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L)	CytoNiche Biotech	R020-10-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L)	CytoNiche Biotech	R020-05-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.
3D TableTrix microcarriers G02	CytoNiche Biotech	G02-10-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.
3D TableTrix microcarriers V01	CytoNiche Biotech	V01-100-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.
3D TableTrix microcarriers W01	CytoNiche Biotech	W01-10-10g (single-use packaging); W01-200 (tablets)	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]
APC anti-human CD45 Antibody	BioLegend	368512	Used in flow cytometry for MSC identity assessment
Calcein-AM/PI Double Staining Kit	Dojindo	C542	Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	CAP-38	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in)	Saint-Gobain	374-250-3	Used for tube welding and disconnection.
CryoMACS Freezing Bag 50	Miltenyi Biotec	200-074-400	Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit.
Dimethyl Sulfate (DMSO)	Sigma	D2650-100mL	Used for preparation of cryopreservation solution.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	BasalMedia	L120KJ	Used for cultivation of HEK293T and Vero cells.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L)	DWK life sciences	218016357	Used for waste collection from the 5 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L)	DWK life sciences	218017353	Used for waste collection from the 15 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL)	DWK life sciences	218014459	Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.
EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	EZ500 ML-38-2	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Fetal bovine serum (FBS) superior quality	Wisent	086-150	Used for cultivation of HEK293T cells.
FITC anti-human CD14 Antibody	BioLegend	301804	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD34 Antibody	BioLegend	343504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody	BioLegend	328108	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Flow cytometry	Beckman Coulter	CytoFLEX	Used for cell identity assessment.
Fluorescence Cell Analyzer	Alit life science	Countstar Rigel S2	Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.
GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports	DWK life sciences	292632806	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Glucose Meter	Sinocare	6243578	Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium	Gibco	14025092	Used for preparation of digest solution.
Human Albumin 20% Behring (HSA)	CSL Behring	N/A	Used for preparation of wash buffer.
Inverted fluorescent microscope	OLYMBUS	CKX53SF	Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging.
Nalgene Measuring Cylinder (500 mL)	Thermo Scientific	3662-0500PK	Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.
Newborn calf serum (NBS) superfine	MINHAI BIO	SC101.02	Used for cultivation of Vero cells.
OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90031	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90041	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90021	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
PE anti-human CD105 Antibody	BioLegend	800504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD19 Antibody	BioLegend	302208	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344004	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human HLA-DR Antibody	BioLegend	307605	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Wisent	311-010-CL	Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.
Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in)	Saint-Gobain	ULTRA-C-125-2F	Used for solution transfering driven by peristaltic pumps.
Sterile Saline	Hopebiol	HBPP008-500	Used for preparation of wash buffer.
Trypzyme Recombinant Trypsin	BasalMedia	S342JV	This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.
Tube Sealer	Yingqi Biotech	Tube Sealer I	This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.
Tube Welder for PVC tubing	Chu Biotech	Tube Welder Micro I	Used for welding of PVC tubing.
Tube Welder for TPE tubing	Yingqi Biotech	Tube Welder I-V2	Used for welding of TPE tubing.
ViaStain AO / PI Viability Stains	Nexcelom	CS2-0106-25mL	Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.