Den presenterade cervikala manipulationsmetoden kan inducera pseudograviditet hos möss utan behov av avelkvinnor med vasektomerade män. Induktion av pseudograviditet krävs för framgång av icke-kirurgisk embryoöverföring och icke-kirurgisk artificiell insemination, vilka båda också presenteras.
För att framgångsrikt upprätthålla graviditet med embryoöverföring eller artificiell insemination måste kvinnliga mottagarmöss induceras till ett pseudogravid tillstånd. Kvinnliga möss paras traditionellt över natten med vasektomerade män, och följande morgon bedöms närvaron av en kopulationsplugg. För att öka effektiviteten vid produktion av pseudogravida kvinnor har en cervikal manipulationsteknik standardiserats för att användas i kombination med icke-kirurgisk embryoöverföring eller artificiell inseminationsteknik hos möss. Den trubbiga änden av en liten plaststav sätts in vaginalt för att komma i kontakt med livmoderhalsen och vibreras i 30 s genom kontakt med en trimmer. Förfarandet är snabbt och kräver inte anestesi eller analgesi. Denna teknik ökar tillförlitligheten och förutsägbarheten för att producera pseudogravida kvinnor och eliminerar helt kravet på vasektomerade män. För CD1-möss var effektiviteten av pseudograviditetsinduktion med cervikal manipulation 83% för kvinnor i estrus (N = 76) men endast 38% av kvinnorna i estrus pluggades av vasektomerade män (N = 24). Artificiell insemination hos CD1-möss utfördes genom estrussynkronisering med hormoner, cervikal manipulation och livmoderöverföring av spermier. Mottagare av artificiell insemination som fick cervikal manipulation (N = 76) hade en graviditetsfrekvens på 72% och en genomsnittlig kullstorlek på 8,3 valpar. Denna metod kan också användas för att producera pseudogravida kvinnor för icke-kirurgisk embryoöverföring. Därför är inducering av pseudograviditet genom cervikal manipulation ett bekvämt och effektivt alternativ till parning med en vasektomerad hane när man utför icke-kirurgiska assisterade reproduktionstekniker. Användning av cervikal manipulation ger 3R (ersättning, reduktion och förfining) fördelar för assisterad reproduktionsteknik genom att minska antalet djur som krävs och eliminera behovet av kirurgiskt förändrade män.
Assisterad reproduktionsteknik används för produktion av genetiskt modifierade musmodeller, liksom återvinning av stammar från kryokonservering, rehärledning av stammar från en nedsatt hälsostatus och strategisk vivariumhantering, inklusive produktion av åldersmatchade kohorter. Alla assisterade reproduktionstekniker hos möss kräver användning av pseudogravida kvinnliga mottagare för embryoutveckling. Historiskt sett har pseudogravida mottagare genererats genom parning med sterila hanar, som antingen är kirurgiskt vasektomerade eller genetiskt infertila, och närvaron av en kopulationsplugg bedöms följande morgon1. Nyligen har ett protokoll för sonisk stimulering hos möss utvecklats för kirurgisk överföring av pronukleära eller tvåcelliga musembryon2. Vi har också utvecklat ett cervikal manipulationsprotokoll (CM) för användning med artificiell insemination och icke-kirurgisk embryoöverföring av blastocyster. Anledningen till användningen av förfarandet är att ge en 3R-minskning av antalet djur som krävs (kräver inte längre hanmöss) och en förfining av de använda teknikerna (som inte längre kräver kirurgisk vasektomiprocedur för hanmöss). Beskrivningen av detta protokoll inkluderar tillhörande assisterad reproduktionsteknik för att underlätta integrationen av CM i normala arbetsflöden. Det övergripande målet med CM-metoden är att ersätta användningen av hanmöss vid generering av pseudogravida honor för assisterad befruktning, inklusive artificiell insemination och embryoöverföring.
CM-protokollet som beskrivs här utvecklades först för att hjälpa till med artificiell insemination hos möss. Det artificiella inseminationsprotokollet, som ursprungligen beskrivits, uppnådde en graviditetshastighet på 50%, med en genomsnittlig kullstorlek på 7 valpar3. CD1-mottagarmöss var estrous synkroniserade med en låg dos hormoner, inklusive serumgonadotropin (PMSG) och humant koriongonadotropin (hCG), vid ett 47-timmarsintervall före insemination. En fördel med estrous synkronisering var att det tillät användning av protokollet under normal arbetstid. Kvinnor parades med vasektomerade män omedelbart efter artificiell insemination, och parning bekräftades av närvaron av en kopulationsplugg. Inkonsekvens i parningshastigheten med mottagare rapporterades som en svårighet i proceduren. Därför söktes alternativ till parning för induktion av pseudograviditet.
Den aktuella studien presenterar en standardiserad CM-teknik för att öka effektiviteten vid produktion av pseudogravida kvinnor. För kvinnor i estrus eller proestrus sätts den trubbiga änden av en liten plaststav vaginalt in för att komma i kontakt med livmoderhalsen och vibreras i 30 s genom kontakt med en trimmer. Förfarandet utförs på en trådtoppad bur. Ingen anestesi eller analgesi krävs. CM-tekniken är lämplig för att producera pseudogravida kvinnor, som kan producera kullar efter icke-kirurgisk artificiell insemination utan behov av parning med vasektomerade män. CM kan också användas för produktion av pseudogravida kvinnor som mottagare av embryoöverföring. Specifikt kan CM-tekniken paras ihop med icke-kirurgisk embryoöverföring, som beskrivs här. Icke-kirurgiska metoder har visat sig vara effektiva för embryoöverföring av embryon i blastocyststadiet hos mus 4,5 och råtta 6,7. Eftersom denna icke-kirurgiska metod är ett effektivt alternativ till kirurgiska metoder anses det vara en 3R-förfining av tekniken. Baserat på tidigare forskning indikerar fekala kortikosteronnivåer, som ett mått på stress, att procedurens icke-kirurgiska karaktär inte ökar stressnivåerna hos gnagare 7,8. Ingreppen är mindre tekniskt utmanande än kirurgisk embryoöverföring och är mycket snabbare att utföra. När embryon överförs till livmodern måste embryon i rätt stadium för livmoderutveckling överföras. För möss överförs blastocyster till 2,5 dagar post coitum (dpc) pseudogravida mottagare.
För de två icke-kirurgiska tekniker som beskrivs här skiljer sig tidpunkten för hormonadministrering och CM-tekniken. Tidpunkten för CM-proceduren i förhållande till estrus är viktig för framgång, eftersom den ersätter naturlig parning för produktion av pseudogravida mottagare. Genom att eliminera behovet av vasektomerade män för att inducera pseudograviditet, ger denna procedur 3R-fördelar genom att både minska antalet djur som krävs och eliminera behovet av kirurgiskt förändrade män. Förfarandet i sig är snabbt (30 s) och kräver inte anestesi eller analgesi. Tekniken ökar kraftigt tillförlitligheten och förutsägbarheten för att producera pseudogravida kvinnor för assisterad befruktning.
3R är en etisk ram för djuranvändning i forskning, som beskrevs 1959 av Russel och Burch i “The Principles of Humane Experimental Technique”15. 3R representerar ersättning, minskning och förfining i djuranvändning. Protokollen som markeras här är i linje med 3R. Den cervicala manipulationstekniken minskar antalet djur som behövs genom att inte längre kräva användning av män för att producera pseudogravida kvinnor. Tekniken eliminerar också behovet av att utföra vasektomier på männen, vilket ger förfining genom att minska smärta och nöd. De assisterade reproduktionstekniker som beskrivs här (artificiell insemination och embryoöverföring) är icke-kirurgiska och ger därför båda en 3R-förfining genom att minska smärta och ångest8orsakad av deras kirurgiska alternativ.
Användningen av pseudogravida kvinnor är nödvändig för återhämtning av valpar vid assisterad reproduktion hos möss1. CM-proceduren är en effektiv metod för att producera pseudogravida kvinnor, men synkroniseringen av fasen i brunstcykeln hos mottagarhonorna är ett kritiskt första steg i processen. Estrous synkronisering kan drastiskt minska antalet honor som behövs i kolonin för att förbereda potentiella mottagare och hjälper till att producera tidsinställda pseudogravida honor på begäran. Användning av en låg dos hormoner verkar inte orsaka några skadliga effekter på återhämtningen av levande kullar hos CD1-möss. Försiktighet måste iakttas med andra stammar för att hitta den hormon- och koncentrationskombination som ger de bästa mottagarhonorna för de överförda embryona eller spermierna. Synkronisering kan uppnås med PMSG och hCG16, men doser som producerar superovulerade honor kanske inte är lämpliga för en långvarig graviditet17.
För att avgöra om en kvinna är i estrus utfördes en cytologisk utvärdering i detta arbete. Estrousfasen kan också utvärderas genom observation av vaginalöppningen11,18. Även om denna metod är extremt användbar och kan användas av sig själv eller som bekräftelse, är den mer subjektiv än användningen av cytologi. Vaginal cytologi utan färgning är både snabb och effektiv för att välja kvinnor i estrus eftersom kornade epitelceller lätt kan identifieras. I detta protokoll utförs den cytologiska utvärderingen före CM för att bestämma potentiella mottagare. Det är viktigt att utföra cytologi före CM, eftersom proceduren tenderar att fragmentera cellerna som sloughed från vaginalområdet, vilket gör identifieringen svår. Cytologisk utvärdering för pseudograviditet eller graviditet kan utföras 3,5-11,5 dagar efter CM (dpcm) i 3 dagar i följd. Profilen för en estrous cyklande kvinna bör ha minst 1 dag med betydande infiltration av kornade epitelceller. Pseudogravida/dräktiga honor bör uppvisa en diestrusprofil (mestadels leukocyter med potentiellt lågt cellantal) under 3 dagar i följd.
Genom utvecklingen av CM-tekniken visade sig vissa möss vara mer mottagliga för proceduren än andra. CD1 kvinnliga möss är utmärkta kandidater på grund av deras lugna natur och utmärkta vårdande instinkter. Denna stam är lätt att hantera och fungerar bra under CM och icke-kirurgisk assisterad reproduktionsteknik. C57Bl/6-möss tenderar att vara mer aggressiva och mindre vårdande. Även om detta protokoll effektivt producerade pseudogravida C57Bl/6-honor med CM, var de mindre benägna att vara konsekvent tillåtande för proceduren. Detta tycktes korrelera något med estrousfasen under CM. Kvinnor i estrus eller proestrus var mer mottagliga. Användningen av ett anrikningsrör för djuret att komma in tillät tillgång till vagina för proceduren och hjälpte till att lugna kvinnan. Förfarandet i sig hindrar inte helt kvinnan, så djuret kan dra sig bort när som helst. Om detta inträffar kan djuret omplaceras, och proceduren kan sedan fortsättas. Tidpunkten för proceduren stannar om kvinnan går bort och återupptas när proceduren återupptas. Avgörande för procedurens framgång är fasen av estrouscykeln (sen proestrus och estrus) och stångens kontakt med livmoderhalsen. Trimmerens vibrationer ger standardiserad CM. För att säkerställa kontakt med livmoderhalsen appliceras försiktigt tryck på stången, och stångens placering mot livmoderhalsen säkerställs med små fram och tillbaka rörelser av stången.
Användningen av CM har förbättrat NSAI-protokollet, eftersom honor i rätt fas av estrouscykeln kan väljas före spermieöverföring, och protokollet är inte längre beroende av parning med vasektomerade män. Den artificiella inseminationen estrous cykel synkronisering är tidsinställd så att oocytmognad motsvarar spermieöverföring på morgonen dag 4. Avgörande för protokollets framgång är anpassningen av tidpunkten för ägglossningen så att befruktning kan ske. Försiktighet måste iakttas för att administrera hCG 15-17 h före förväntad spermieöverföring, vilket föreslås för de tidpunkter som används för in vitro-fertilisering 1. Kvaliteten på spermaprovet kommer direkt att påverka resultatet av artificiell insemination. Färska spermier som har kapacitaterats kommer att fungera bäst. Kryokonserverade spermier av god kvalitet kan producera befruktade embryon in vivo. Försiktighet bör dock iakttas vid direkt överföring av tinade spermier, eftersom kvarvarande kryoprotektiva medel som överförs till livmoderhornet kan hämma implantation (opublicerade observationer).
Användningen av CM i samband med embryoöverföring är konceptuellt en enkel anpassning. Estrous cykelsynkronisering minskar antalet honor som behövs för att producera mottagarpoolen. Bestämning av estrousstadiet före CM ökar sannolikheten för att erhålla pseudogravida mottagare. En nackdel med metoden är att mottagarens cytologi vid tidpunkten för embryoöverföringen befinner sig i ett flödesstadium. Alla celltyper är närvarande om honan övergår från estrus till pseudograviditetsprofilen, och pseudograviditet blir uppenbar endast om cytologin spåras i flera dagar. Baserat på framgången (>80%) med övergången från brunst till pseudograviditet för CD1- och C57Bl/6-möss förväntas denna metod vara lämplig för embryoöverföringsmottagare. De preliminära resultaten visar goda framgångar med begränsad icke-kirurgisk embryoöverföring. I allmänhet är effektiviteten hos icke-kirurgisk embryoöverföring jämförbar med den för kirurgisk teknik4,5, och icke-kirurgisk överföring kan ersätta kirurgiska embryoöverföringar i blastocyststadiet. För embryon i tidigare stadium krävs embryoodling till blastocyststadiet. Om en kirurgisk överföring föredras är det dock möjligt att anpassa CM-tekniken till rätt tidpunkt som behövs för lämpliga pseudogravida mottagare2. I allmänhet är embryomottagarna 1 dag mindre avancerade än embryot. Till exempel skördas blastocyster vid 3,5 dpc från givare och överförs till 2,5 dpc-mottagare. Därför måste CM utföras så att mottagaren är i ett mindre utvecklat pseudogravid tillstånd än embryon.
Sammanfattningsvis visar CM-tekniken som beskrivs här utmärkt löfte för integration med andra assisterade reproduktionstekniker för möss. Vi har tillhandahållit framgångsrika protokoll för artificiell insemination och embryoöverföring med hjälp av icke-kirurgiska tekniker. I kombination ger CM-tekniken 3R-fördelar, inklusive (1) en minskning av antalet djur genom att eliminera behovet av vasektomerade män och (2) en förfining av tekniker genom att ersätta kirurgiska tekniker med icke-kirurgiska alternativ.
The authors have nothing to disclose.
Forskningen som rapporteras i denna publikation stöddes av Office of the Director, Office of Research Infrastructure Programs, vid National Institutes of Health under Award Number R43OD020304 och National Institute of Mental Health vid National Institutes of Health under Award Number R44MH122117. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health.
Blastocyst stage embryos | |||
CARD Fertiup Preincubation Medium (PM) | CosmoBio | KYD-002-EX | For sperm capacitation |
Embryo handling pipette | Cook Medical | K-FPIP-1120-10BS | Flexipet is available in various diameters |
Embryo handling pipette assembly | Paratechs | 90010 | |
Female mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | Toothed, for dissection |
Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Curved, for dissection |
Forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 | Fine, for dissection |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | Optional |
human Chorionic Gonadotropin (hCG) | Prospec | hor-250 | For estrus synchronization |
Incubator, 37 °C 5% CO2 | Thermo Scientific | ||
Incubator, 37 °C, benchtop | Cook | K-MINC-1000 | |
Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | Absorbant tissues |
M2 medium | Millipore | MR-015-D | Embryo handling medium |
Male mice, Crl:CD1(ICR) | Charles River Laboratories | 22 | >8 weeks old |
mC&I device | ParaTechs | 60020 | For sperm transfer, specula included |
mCM rod | ParaTechs | 90050 | Smooth, blunt, with a diameter @3 mm |
Microscope | Olympus | SZX7 | 20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections |
Microscope | ACCU-SCOPE | 3032 | 100x magnification with bright field illumination |
Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
mNSET device | ParaTechs | 60010 | For embryo transfer, specula included |
Needles, 26 G | Exel | 26402 | |
Papanicolaou Staining System | VWR | 76265-730 | Optional |
Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 18512 | |
Pipette, P200 | Corning | 4074 | Fits the C&I device for sperm transfer |
Pipette, PR-2 | Rainin | 17008648 | Fits the NSET device for embryo transfer |
Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | Prospec | hor-272 | For estrus synchronization |
Scale | American Weigh Scales | LB-1000 | |
Scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Dissection |
Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | Angled, dissection |
Swabs, Constix | Contec | SC-4 | For vaginal cytology |
Syringes, 1 cc | Becton Dickenson and Company | 309659 | |
Tissue culture dishes, 35 mm | Falcon | 353001 | |
Tissue culture dishes, 60 mm | Falcon | 353004 | |
Trimmer | Wahl | ChroMini T-Cut | |
Wire bar topped mouse cage |