Respirometri med høj opløsning til vurdering af mitokondriefunktion i humane spermatozoer

Summary

Analysen af sædmitokondriefunktion ved respirometri med høj opløsning tillader måling af iltforbruget af frit bevægelige spermatozoer i et lukket kammersystem. Teknikken kan anvendes til at måle åndedræt i humane spermatozoer, hvilket giver information om sædmitokondrieegenskaber og integritet.

Abstract

Sædkvalitet studeres ofte ved rutinemæssig sædanalyse, som er beskrivende og ofte ufattelig. Mandlig infertilitet er forbundet med ændret sædmitokondrieaktivitet, så måling af sædmitokondriefunktion er en indikator for sædkvalitet. Respirometri med høj opløsning er en metode til måling af iltforbruget af celler eller væv i et lukket kammersystem. Denne teknik kan implementeres til at måle åndedræt i menneskelig sæd og giver information om sædmitokondriernes kvalitet og integritet. Respirometri med høj opløsning gør det muligt for cellerne at bevæge sig frit, hvilket er en a priori fordel i tilfælde af sædceller. Denne teknik kan anvendes med intakte eller permeabiliserede spermatozoer og muliggør undersøgelse af intakt sædmitokondriefunktion og aktiviteten af individuelle åndedrætskædekomplekser. Det højopløselige oxygrafinstrument bruger sensorer til at måle iltkoncentrationen kombineret med følsom software til at beregne iltforbruget. Dataene bruges til at beregne respiratoriske indekser baseret på iltforbrugsforholdene. Derfor er indekserne proportionerne af to iltforbrugshastigheder og normaliseres internt til celleantallet eller proteinmassen. Respiratoriske indekser er en indikator for sædmitokondriefunktion og dysfunktion.

Introduction

Mandlig infertilitet anslås at tegne sig for 40% -50% af alle tilfælde af infertilitet hos par¹. Konventionel sædanalyse spiller en afgørende rolle i bestemmelsen af mandlig fertilitet; Imidlertid har ca. 15% af infertile mænd normale sædparametre². Derudover giver rutinemæssig sædanalyse begrænset information om sædfunktion og afspejler ikke subtile sæddefekter³.

Spermmitokondrier har en særlig struktur, da de er arrangeret som en spiralformet kappe omkring flagellen. Mitokondrieskeden indeholder et variabelt antal mitokondrier forbundet med intermitokondriebindinger og forankret til cytoskelettet ved ordnede proteinarrangementer på den ydre mitokondriemembran ^4,5. Denne struktur gør det særligt vanskeligt at isolere sædmitokondrier. Derfor bruger de fleste undersøgelser af sædmitokondriefunktion in situ-analyser eller afmembranerede sædceller⁶.

Sperm mitokondrie struktur og funktion har været konsekvent forbundet med mandlig infertilitet 7,8,9,10,11, hvilket tyder på^, at analyse af strukturen og funktionen af disse organeller kan være en god kandidat til optagelse i sædanalyse.

Mitokondrier spiller en vigtig rolle i cellulær energimetabolisme, især ved at bruge ilt til at producere adenosintrifosfat (ATP) gennem oxidativ phosphorylering (OXPHOS). Især i spermatozoer er kilden til ATP (glykolyse vs. OXPHOS) omstridt, og mange af dataene forbliver kontroversielle og afhænger af forskellige eksperimentelle tilgange 4,12,13. Målinger af respiration ved oximetri giver betydelig indsigt i mitokondriel åndedrætskapacitet, mitokondriel integritet og energimetabolisme af cellen^14,15,16. Traditionelt er denne teknik blevet udført ved hjælp af Clark oxygenelektrode – et instrument, der er blevet brugt til at måle mitokondriel respiration i mere end 50 år^17,18. Derudover er sædmitokondriets iltforbrug blevet analyseret ved hjælp af den klassiske Clark iltelektrode 19,20,21. Respirometri med høj opløsning (HRR) ved hjælp af oxygrafer (Oroboros) giver højere følsomhed end ved brug af klassiske respirometriindretninger²². Oxygraferne består af to kamre med injektionsporte, og hvert kammer har en polarografisk iltføler. Med denne teknik er det muligt at analysere vævsdias, celler og isolerede mitokondriesuspensioner. Prøven omrøres kontinuerligt i kammeret, og under eksperimentet måles iltforbruget, og ilthastighederne beregnes ved hjælp af specifik software. Kamrene viser reduceret iltlækage, hvilket er en fordel i forhold til de konventionelle iltelektrodeanordninger^14,23.

Som med andre celler, i tilfælde af spermatozoer, er følsomheden af HRR-udstyr højere end for konventionel respirometri, hvilket betyder, at HRR-udstyr kan bruges til analyse af et begrænset antal intakte eller permeabiliserede sædceller. Der er to hovedstrategier til vurdering af sædmitokondriefunktion ved HRR: (a) måling af iltforbruget i intakte celler, hvilket indebærer reproduktion af åndedrætsfunktionen i et medium, der indeholder substrater såsom glukose, eller (b) måling af iltforbruget i permeabiliserede celler ved hjælp af et af OXPHOS-komplekserne med tilsætning af specifikke substrater til overvågning af hver funktion separat.

I denne undersøgelse beskriver vi brugen af HRR til bestemmelse af mitokondriel respiration i humane sædceller.

Protocol

Forsøgene blev godkendt af den etiske komité ved Facultad de Medicina de la Universidad de la República, Montevideo, Uruguay. Figur 1: Workflow for respirometri med høj opløsning til vurdering af mitokondriefunktion i intakt og permeabiliseret human sæd. Protokollen blev opdelt i fire forskellige trin: 1) forberedel…

Representative Results

Bestemmelse af den optimale koncentration af digitonin i sædcellerI denne protokol præsenterer vi brugen af HRR til at overvåge ændringer i realtid i OXPHOS i humane sædceller. Da metoden kan bruges til at analysere intakt eller digitoninpermeabiliseret sæd, præsenterer vi først standardiseringen af digitoninkoncentration, der kræves for at permeabilisere sædceller (figur 3). Digitonin anvendes til kemisk permeabilisering, som gør d…

Discussion

HRR afhænger kritisk af flere trin: (a) vedligeholdelse af udstyr, (b) nøjagtig kalibrering af iltsensorerne, (c) frakoblingstitreringen²⁶ og endelig (d) tilstrækkelig brug af indekser, der repræsenterer mitokondriefunktionen. Vedligeholdelse af udstyr er afgørende. Det anbefales at udskifte membranerne i den polarografiske iltføler regelmæssigt og korrigere den instrumentelle baggrund. Omfattende vask efter indsamling af spermatozoer fra kamrene er afgørende for at opnå gode replikater, …

Materials

Acid free- Bovine serum albumine	Sigma Aldrich	A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma Aldrich	A5285
Animycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920
DatLab sofware version 4,2	Oroboros Instruments GmbH	N/A
D-glucose	Sigma Aldrich	G7021
Digitonin	Sigma Aldrich	D141
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
L glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L malic acid	Sigma Aldrich	M1000
Magnesium sulphate	Sigma Aldrich	M7506
Microliter Syringes	Hamilton	87900 or 80400
Microscope camera	Basler	acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+	Nikon	N/A
Monopotassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
MOPS	Sigma Aldrich	M1254
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Oxygraph-2 K	Oroboros Instruments GmbH	N/A
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911
Power O2k-Respirometer	Oroboros Intruments	10033-01
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sodium lactate	Sigma Aldrich	L7022
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research	Microptic	N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600	Millennium Sciences CELL-VU	N/A
Succinate disodium salt	Sigma Aldrich	W327700