قياس التنفس عالي الدقة لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في الحيوانات المنوية البشرية
Summary
يسمح تحليل وظيفة الميتوكوندريا للحيوانات المنوية عن طريق قياس التنفس عالي الدقة بقياس استهلاك الأكسجين للحيوانات المنوية المتحركة بحرية في نظام الغرفة المغلقة. يمكن تطبيق هذه التقنية لقياس التنفس في الحيوانات المنوية البشرية ، والتي توفر معلومات عن خصائص الميتوكوندريا المنوية وسلامتها.
Abstract
غالبا ما تتم دراسة جودة السائل المنوي عن طريق تحليل السائل المنوي الروتيني ، وهو وصفي وغالبا ما يكون غير حاسم. يرتبط العقم عند الذكور بنشاط الميتوكوندريا للحيوانات المنوية المتغيرة ، وبالتالي فإن قياس وظيفة الميتوكوندريا للحيوانات المنوية هو مؤشر على جودة الحيوانات المنوية. قياس التنفس عالي الدقة هو طريقة لقياس استهلاك الأكسجين للخلايا أو الأنسجة في نظام الغرفة المغلقة. يمكن تنفيذ هذه التقنية لقياس التنفس في الحيوانات المنوية البشرية وتوفر معلومات حول جودة وسلامة الميتوكوندريا المنوية. يسمح قياس التنفس عالي الدقة للخلايا بالتحرك بحرية ، وهي ميزة مسبقة في حالة الحيوانات المنوية. يمكن تطبيق هذه التقنية مع الحيوانات المنوية السليمة أو المتداخلة وتسمح بدراسة وظيفة الميتوكوندريا المنوية السليمة ونشاط مجمعات السلسلة التنفسية الفردية. تستخدم أداة oxygraph عالية الدقة أجهزة استشعار لقياس تركيز الأكسجين إلى جانب برامج حساسة لحساب استهلاك الأكسجين. تستخدم البيانات لحساب مؤشرات الجهاز التنفسي بناء على نسب استهلاك الأكسجين. وبالتالي ، فإن المؤشرات هي نسب معدلين لاستهلاك الأكسجين ويتم تطبيعها داخليا إلى عدد الخلايا أو كتلة البروتين. مؤشرات الجهاز التنفسي هي مؤشر على وظيفة الميتوكوندريا المنوية والخلل الوظيفي.
Introduction
يقدر أن العقم عند الذكور يمثل 40٪ -50٪ من جميع حالات العقم عند الأزواج1. يلعب تحليل السائل المنوي التقليدي دورا حاسما في تحديد خصوبة الذكور. ومع ذلك ، فإن ما يقرب من 15 ٪ من الرجال المصابين بالعقم لديهم معايير الحيوانات المنوية الطبيعية2. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر تحليل السائل المنوي الروتيني معلومات محدودة حول وظيفة الحيوانات المنوية ولا يعكس عيوب الحيوانات المنوية الدقيقة3.
الميتوكوندريا المنوية لها بنية خاصة ، حيث يتم ترتيبها كغمد حلزوني حول السوط. يحتوي غمد الميتوكوندريا على عدد متغير من الميتوكوندريا المتصلة بواسطة روابط بين الميتوكوندريا ومثبتة على الهيكل الخلوي عن طريق ترتيبات البروتين المطلوبة على غشاء الميتوكوندريا الخارجي 4,5. هذا التركيب يجعل من الصعب بشكل خاص عزل الميتوكوندريا المنوية. لذلك ، فإن معظم الدراسات حول وظيفة الميتوكوندريا للحيوانات المنوية تستخدم التحليلات في الموقع أو الحيوانات المنويةالمفككة 6.
تم ربط بنية الميتوكوندريا المنوية ووظيفتها باستمرار بالعقم عند الذكور7،8،9،10،11 ، مما يشير إلى أن تحليل بنية ووظيفة هذه العضيات قد يكون مرشحا جيدا لإدراجها في تحليل الحيوانات المنوية.
تلعب الميتوكوندريا دورا مهما في استقلاب الطاقة الخلوية ، لا سيما باستخدام الأكسجين لإنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) من خلال الفسفرة التأكسدية (OXPHOS). في الحيوانات المنوية ، على وجه الخصوص ، مصدر ATP (تحلل السكر مقابل OXPHOS) متنازع عليه ، ولا يزال الكثير من البيانات مثيرا للجدل ويعتمد على مناهج تجريبية مختلفة4،12،13. تقدم قياسات التنفس عن طريق قياس التأكسج رؤى مهمة حول القدرة التنفسية للميتوكوندريا ، وسلامة الميتوكوندريا ، واستقلاب الطاقة للخلية14،15،16. تقليديا ، تم تنفيذ هذه التقنية باستخدام قطب الأكسجين كلارك – أداة تم استخدامها لقياس تنفس الميتوكوندريا لأكثر من 50 عاما17,18. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحليل استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا المنوية باستخدام قطب الأكسجين الكلاسيكيكلارك 19،20،21. يوفر قياس التنفس عالي الدقة (HRR) باستخدام أجهزة الأوكسجين (Oroboros) حساسية أعلى من استخدام أجهزة قياس التنفس الكلاسيكية22. تتكون أجهزة الأوكسجين من غرفتين مع منافذ حقن ، وتحتوي كل غرفة على مستشعر أكسجين بولاروغرافي. باستخدام هذه التقنية ، من الممكن تحليل شرائح الأنسجة والخلايا ومعلقات الميتوكوندريا المعزولة. يتم تحريك العينة باستمرار في الغرفة ، وخلال التجربة ، يتم قياس استهلاك الأكسجين ، ويتم حساب معدلات الأكسجين باستخدام برنامج محدد. تظهر الغرف انخفاضا في تسرب الأكسجين ، وهي ميزة على أجهزة قطب الأكسجين التقليدية14,23.
كما هو الحال مع الخلايا الأخرى ، في حالة الحيوانات المنوية ، تكون حساسية معدات HRR أعلى من قياس التنفس التقليدي ، مما يعني أنه يمكن استخدام معدات HRR لتحليل عدد محدود من خلايا الحيوانات المنوية السليمة أو المتخللة. هناك استراتيجيتان رئيسيتان لتقييم وظيفة الميتوكوندريا للحيوانات المنوية بواسطة HRR: (أ) قياس استهلاك الأكسجين في الخلايا السليمة ، والذي يتضمن إعادة إنتاج وظيفة الجهاز التنفسي في وسط يحتوي على ركائز مثل الجلوكوز ، أو (ب) قياس استهلاك الأكسجين في الخلايا النفاذية باستخدام أحد معقدات OXPHOS ، مع إضافة ركائز محددة لمراقبة كل وظيفة على حدة.
في هذه الدراسة ، وصفنا استخدام HRR لتحديد تنفس الميتوكوندريا في خلايا الحيوانات المنوية البشرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعتمد HRR بشكل حاسم على عدة خطوات: (أ) صيانة المعدات ، (ب) المعايرة الدقيقة لأجهزة استشعار الأكسجين ، (ج) معايرة جهاز فكالتوصيل 26 ، وأخيرا ، (د) الاستخدام المناسب للمؤشرات التي تمثل وظيفة الميتوكوندريا. صيانة المعدات أمر بالغ الأهمية. يوصى باستبدال أغشية مستشعر الأكسجين البولاروغ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر عيادة فيرتيلاب لأمراض الذكورة ، وخاصة خوسيه ماريا مونتيس وأندريا تورنتس ، للسماح لنا بالوصول إلى المتبرعين. التمويل: يتم دعم AC بمنح من جامعة الجمهورية (CSIC_2018 ، Espacio Interdisciplinario_2021). وتم الحصول على تمويل إضافي من برنامج تنمية العلوم البيولوجية (PEDECIBA، أوروغواي). يتم دعم PI و R.S. من قبل Universidad de la República (I + D ، CSIC 2014 ؛ I + D ، CSIC 2016 ، Iniciación a la Investigación ، CSIC 2019 و FMV_1_2017_1_136490 ANII- أوروغواي). يتم دعم PI من قبل POS_FMV_2018_1_1007814 و CAP-UDELAR 2020. تم توضيح الأرقام باستخدام Biorender.com.
Materials
| Acid free- Bovine serum albumine | Sigma Aldrich | A8806 | |
| Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma Aldrich | A5285 | |
| Animycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
| carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | |
| DatLab sofware version 4,2 | Oroboros Instruments GmbH | N/A | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| L glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
| L malic acid | Sigma Aldrich | M1000 | |
| Magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Microliter Syringes | Hamilton | 87900 or 80400 | |
| Microscope camera | Basler | acA780-75gc | |
| Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+ | Nikon | N/A | |
| Monopotassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | |
| MOPS | Sigma Aldrich | M1254 | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Oxygraph-2 K | Oroboros Instruments GmbH | N/A | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Power O2k-Respirometer | Oroboros Intruments | 10033-01 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Sodium lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | |
| Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research | Microptic | N/A | |
| Sperm Counting Chamber DRM-600 | Millennium Sciences CELL-VU | N/A | |
| Succinate disodium salt | Sigma Aldrich | W327700 |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 37 (2015).
- Guzick, D. S., et al. Sperm morphology, motility, and concentration in fertile and infertile men. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1388-1393 (2001).
- Wang, C., Swerdloff, R. S. Limitations of semen analysis as a test of male fertility and anticipated needs from newer tests. Fertility and Sterility. 102 (6), 1502-1507 (2014).
- Amaral, A. Energy metabolism in mammalian sperm motility. WIREs Mechanisms of Disease. 14 (5), e1569 (2022).
- Leung, M. R., et al. In-cell structures of conserved supramolecular protein arrays at the mitochondria-cytoskeleton interface in mammalian sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (45), e2110996118 (2021).
- Moraes, C. R., Meyers, S. The sperm mitochondrion: Organelle of many functions. Animal Reproduction Science. 194, 71-80 (2018).
- Cassina, A., et al. Defective human sperm cells are associated with mitochondrial dysfunction and oxidant production. Biology of Reproduction. 93 (5), 119 (2015).
- Marchetti, C., Obert, G., Deffosez, A., Formstecher, P., Marchetti, P. Study of mitochondrial membrane potential, reactive oxygen species, DNA fragmentation and cell viability by flow cytometry in human sperm. Human Reproduction. 17 (5), 1257-1265 (2002).
- Amaral, A., Lourenço, B., Marques, M., Ramalho-Santos, J. Mitochondria functionality and sperm quality. Reproduction. 146 (5), R163-R174 (2013).
- Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), e13666 (2021).
- Uribe, P., et al. Use of the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester perchlorate for mitochondrial membrane potential assessment in human spermatozoa. Andrologia. 49 (9), e12753 (2017).
- Storey, B. T. Mammalian sperm metabolism: Oxygen and sugar, friend and foe. The International Journal of Developmental Biology. 52 (5-6), 427-437 (2008).
- Tourmente, M., Sansegundo, E., Rial, E., Roldan, E. R. S. Capacitation promotes a shift in energy metabolism in murine sperm. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 950979 (2022).
- Gnaiger, E., Dykens, J. A., Will, Y. Chapter 12 – Polarographic oxygen sensors, the oxygraph, and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. , 325-352 (2008).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Awadhpersad, R., Jackson, C. B. High-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e63000 (2021).
- Chance, B., Williams, G. R. A simple and rapid assay of oxidative phosphorylation. Nature. 175 (4469), 1120-1121 (1955).
- Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
- Stendardi, A., et al. Evaluation of mitochondrial respiratory efficiency during in vitro capacitation of human spermatozoa. International Journal of Andrology. 34 (3), 247-255 (2011).
- Ferramosca, A., Focarelli, R., Piomboni, P., Coppola, L., Zara, V. Oxygen uptake by mitochondria in demembranated human spermatozoa: A reliable tool for the evaluation of sperm respiratory efficiency. International Journal of Andrology. 31 (3), 337-345 (2008).
- Ferramosca, A., et al. Modulation of human sperm mitochondrial respiration efficiency by plant polyphenols. Antioxidants. 10 (2), 217 (2021).
- Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Méndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 27 (6), 583-596 (1995).
- . O2k Quality Control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration Available from: https://www.bioblst.at/images/archive/7/77/20210819114548%21MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP.pdf (2020)
- WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2010)
- . O2k-protocols SOP: O2k quality control 1 Available from: https://www.bioblast.at/images/9/9c/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP_DatLab8.pdf (2021)
- Gnaiger, E. . Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. , (2012).
- Steinlechner-Maran, R., Eberl, T., Kunc, M., Margreiter, R., Gnaiger, E. Oxygen dependence of respiration in coupled and uncoupled endothelial cells. The American Journal of Physiology. 271, C2053-C2061 (1996).
- Holt, W. V., Van Look, K. J. W. Concepts in sperm heterogeneity, sperm selection and sperm competition as biological foundations for laboratory tests of semen quality. Reproduction. 127 (5), 527-535 (2004).
- Sousa, A. P., et al. Not all sperm are equal: Functional mitochondria characterize a subpopulation of human sperm with better fertilization potential. PloS One. 6 (3), e18112 (2011).
- Moscatelli, N., et al. Single-cell-based evaluation of sperm progressive motility via fluorescent assessment of mitochondria membrane potential. Scientific Reports. 7, 17931 (2017).
- Ferreira, J. J., et al. Increased mitochondrial activity upon CatSper channel activation is required for mouse sperm capacitation. Redox Biology. 48, 102176 (2021).
- Irigoyen, P., et al. Mitochondrial metabolism determines the functional status of human sperm and correlates with semen parameters. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 926684 (2022).
