Respirométrie à haute résolution pour évaluer la fonction mitochondriale chez les spermatozoïdes humains
Summary
L’analyse de la fonction mitochondriale des spermatozoïdes par respirométrie à haute résolution permet de mesurer la consommation d’oxygène des spermatozoïdes se déplaçant librement dans un système à chambre fermée. La technique peut être appliquée pour mesurer la respiration dans les spermatozoïdes humains, ce qui fournit des informations sur les caractéristiques et l’intégrité mitochondriales des spermatozoïdes.
Abstract
La qualité du sperme est souvent étudiée par une analyse de routine du sperme, qui est descriptive et souvent peu concluante. L’infertilité masculine est associée à une altération de l’activité mitochondriale des spermatozoïdes, de sorte que la mesure de la fonction mitochondriale des spermatozoïdes est un indicateur de la qualité du sperme. La respirométrie à haute résolution est une méthode de mesure de la consommation d’oxygène des cellules ou des tissus dans un système à chambre fermée. Cette technique peut être mise en œuvre pour mesurer la respiration dans les spermatozoïdes humains et fournit des informations sur la qualité et l’intégrité des mitochondries des spermatozoïdes. La respirométrie à haute résolution permet aux cellules de se déplacer librement, ce qui est un avantage a priori dans le cas des spermatozoïdes. Cette technique peut être appliquée avec des spermatozoïdes intacts ou perméabilisés et permet d’étudier la fonction mitochondriale intacte des spermatozoïdes et l’activité des complexes de chaînes respiratoires individuels. L’instrument oxygraphe haute résolution utilise des capteurs pour mesurer la concentration d’oxygène couplés à un logiciel sensible pour calculer la consommation d’oxygène. Les données sont utilisées pour calculer les indices respiratoires en fonction des ratios de consommation d’oxygène. Par conséquent, les indices sont les proportions de deux taux de consommation d’oxygène et sont normalisés en interne au nombre de cellules ou à la masse protéique. Les indices respiratoires sont un indicateur de la fonction et du dysfonctionnement des mitochondries des spermatozoïdes.
Introduction
On estime que l’infertilité masculine représente 40 à 50 % de tous les cas d’infertilité chez les couples1. L’analyse conventionnelle du sperme joue un rôle crucial dans la détermination de la fertilité masculine ; Cependant, environ 15 % des hommes infertiles ont des paramètres de sperme normaux2. De plus, l’analyse de routine du sperme fournit des informations limitées sur la fonction des spermatozoïdes et ne reflète pas les défauts subtils des spermatozoïdes3.
Les mitochondries des spermatozoïdes ont une structure particulière, car elles sont disposées comme une gaine hélicoïdale autour des flagelles. La gaine mitochondriale contient un nombre variable de mitochondries reliées par des liants intermitochondriaux et ancrées au cytosquelette par des arrangements protéiques ordonnés sur la membrane mitochondriale externe 4,5. Cette structure rend particulièrement difficile l’isolement des mitochondries des spermatozoïdes. Par conséquent, la plupart des études sur la fonction mitochondriale des spermatozoïdes utilisent des analyses in situ ou des spermatozoïdes démembranés6.
La structure et la fonction mitochondriales des spermatozoïdes ont été systématiquement liées à l’infertilité masculine 7,8,9,10,11, ce qui suggère que l’analyse de la structure et de la fonction de ces organites peut être un bon candidat pour l’inclusion dans l’analyse du sperme.
Les mitochondries jouent un rôle important dans le métabolisme énergétique cellulaire, notamment en utilisant l’oxygène pour produire de l’adénosine triphosphate (ATP) par phosphorylation oxydative (OXPHOS). Chez les spermatozoïdes, en particulier, la source de l’ATP (glycolyse vs. OXPHOS) est contestée, et une grande partie des données reste controversée et dépend de différentes approches expérimentales 4,12,13. Les mesures de la respiration par oxymétrie offrent des informations significatives sur la capacité respiratoire mitochondriale, l’intégrité mitochondriale et le métabolisme énergétique de la cellule14,15,16. Traditionnellement, cette technique a été réalisée à l’aide de l’électrode à oxygène de Clark, un instrument utilisé pour mesurer la respiration mitochondriale depuis plus de 50 ans17,18. De plus, la consommation d’oxygène mitochondrial des spermatozoïdes a été analysée à l’aide de l’électrode à oxygène Clark classique 19,20,21. La respirométrie à haute résolution (HRR) à l’aide d’oxygraphes (Oroboros) offre une sensibilité plus élevée que l’utilisation d’appareils de respirométrie classiques22. Les oxygraphes sont composés de deux chambres avec orifices d’injection, et chaque chambre dispose d’un capteur d’oxygène polarographique. Avec cette technique, il est possible d’analyser des lames de tissus, des cellules et des suspensions mitochondriales isolées. L’échantillon est agité en continu dans la chambre, et pendant l’expérience, la consommation d’oxygène est mesurée et les taux d’oxygène sont calculés à l’aide d’un logiciel spécifique. Les chambres présentent une réduction des fuites d’oxygène, ce qui constitue un avantage par rapport aux électrodes d’oxygène conventionnelles14,23.
Comme pour les autres cellules, dans le cas des spermatozoïdes, la sensibilité de l’équipement HRR est plus élevée que celle de la respirométrie conventionnelle, ce qui signifie que l’équipement HRR peut être utilisé pour l’analyse d’un nombre limité de spermatozoïdes intacts ou perméabilisés. Il existe deux stratégies principales pour évaluer la fonction mitochondriale des spermatozoïdes par HRR : (a) mesurer la consommation d’oxygène dans les cellules intactes, ce qui implique de reproduire la fonction respiratoire dans un milieu contenant des substrats tels que le glucose, ou (b) mesurer la consommation d’oxygène dans les cellules perméabilisées à l’aide de l’un des complexes OXPHOS, avec l’ajout de substrats spécifiques pour surveiller chaque fonction séparément.
Dans la présente étude, nous décrivons l’utilisation de la HRR pour déterminer la respiration mitochondriale dans les spermatozoïdes humains.
Protocol
Representative Results
Discussion
La HRR dépend de plusieurs étapes : (a) l’entretien de l’équipement, (b) l’étalonnage précis des capteurs d’oxygène, (c) le titrage du découpleur26, et enfin, (d) l’utilisation adéquate d’indices représentant la fonction mitochondriale. L’entretien de l’équipement est crucial. Il est recommandé de remplacer régulièrement les membranes du capteur d’oxygène polarographique et de corriger le fond instrumental. Un lavage approfondi après le prélèvement des spermatozo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier la clinique d’andrologie Fertilab, en particulier José María Montes et Andrea Torrents, de nous avoir permis d’avoir accès à des donneurs. Financement : A.C. est soutenu par des subventions de l’Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021). Un financement supplémentaire a été obtenu du Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Uruguay). P.I. et R.S. sont soutenus par l’Universidad de la República (I+D, CSIC 2014 ; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 et FMV_1_2017_1_136490 ANII- Uruguay). P.I. est soutenu par POS_FMV_2018_1_1007814 et CAP-UDELAR 2020. Les figures ont été illustrées à l’aide de Biorender.com.
Materials
| Acid free- Bovine serum albumine | Sigma Aldrich | A8806 | |
| Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma Aldrich | A5285 | |
| Animycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
| carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | |
| DatLab sofware version 4,2 | Oroboros Instruments GmbH | N/A | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| L glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
| L malic acid | Sigma Aldrich | M1000 | |
| Magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Microliter Syringes | Hamilton | 87900 or 80400 | |
| Microscope camera | Basler | acA780-75gc | |
| Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+ | Nikon | N/A | |
| Monopotassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | |
| MOPS | Sigma Aldrich | M1254 | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Oxygraph-2 K | Oroboros Instruments GmbH | N/A | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Power O2k-Respirometer | Oroboros Intruments | 10033-01 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Sodium lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | |
| Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research | Microptic | N/A | |
| Sperm Counting Chamber DRM-600 | Millennium Sciences CELL-VU | N/A | |
| Succinate disodium salt | Sigma Aldrich | W327700 |
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