인간 정자의 미토콘드리아 기능을 평가하기 위한 고분해능 호흡 측정법
Summary
고분해능 호흡 측정법에 의한 정자 미토콘드리아 기능 분석은 밀폐 챔버 시스템에서 자유롭게 움직이는 정자의 산소 소비량을 측정할 수 있습니다. 이 기술은 정자 미토콘드리아 특성 및 무결성에 대한 정보를 제공하는 인간 정자의 호흡을 측정하는 데 적용할 수 있습니다.
Abstract
정액의 질은 종종 일상적인 정액 분석을 통해 연구되며, 이는 설명적이며 종종 결정적이지 않습니다. 남성 불임은 정자 미토콘드리아 활동의 변화와 관련이 있으므로 정자 미토콘드리아 기능의 측정은 정자의 질을 나타내는 지표입니다. 고분해능 호흡 측정법은 밀폐 챔버 시스템에서 세포 또는 조직의 산소 소비량을 측정하는 방법입니다. 이 기술은 인간 정자의 호흡을 측정하기 위해 구현될 수 있으며 정자 미토콘드리아의 품질과 무결성에 대한 정보를 제공합니다. 고해상도 호흡 측정법은 세포가 자유롭게 움직일 수 있도록 하며, 이는 정자의 경우 선험적 이점입니다. 이 기술은 온전하거나 투과된 정자와 함께 적용할 수 있으며 온전한 정자 미토콘드리아 기능과 개별 호흡 사슬 복합체의 활성을 연구할 수 있습니다. 고분해능 산소 그래프 기기는 센서를 사용하여 산소 농도를 측정하고 민감한 소프트웨어와 함께 산소 소비량을 계산합니다. 이 데이터는 산소 소비 비율을 기반으로 호흡 지수를 계산하는 데 사용됩니다. 결과적으로, 지수는 두 산소 소비율의 비율이며 내부적으로 세포 수 또는 단백질 질량으로 정규화됩니다. 호흡 지수는 정자 미토콘드리아 기능과 기능 장애를 나타내는 지표입니다.
Introduction
남성 불임은 부부 불임 사례의 40%-50%를 차지하는 것으로 추정된다1. 기존의 정액 분석은 남성의 생식력을 결정하는 데 중요한 역할을 합니다. 그러나 불임 남성의 약 15%는 정상적인 정자 매개변수를 가지고 있다2. 또한, 일상적인 정액 분석은 정자 기능에 대한 제한된 정보를 제공하며 미묘한 정자 결함을 반영하지 않는다3.
정자 미토콘드리아는 편모 주위에 나선형 덮개로 배열되어 있기 때문에 특별한 구조를 가지고 있습니다. 미토콘드리아 외피는 미토콘드리아 간 링커에 의해 연결되고 외부 미토콘드리아 막 4,5 상의 정렬된 단백질 배열에 의해 세포골격에 고정되는 다양한 수의 미토콘드리아를 포함합니다. 이 구조는 정자 미토콘드리아를 분리하는 것을 특히 어렵게 만듭니다. 따라서 정자 미토콘드리아 기능에 대한 대부분의 연구는 현장 분석 또는 demembranated sperm6을 사용한다.
정자 미토콘드리아 구조 및 기능은 남성 불임과 일관되게 연관되어 있으며, 7,8,9,10,11 이러한 세포 기관의 구조와 기능에 대한 분석이 정자 분석에 포함될 수 있음을 시사합니다.
미토콘드리아는 특히 산소를 사용하여 산화적 인산화(OXPHOS)를 통해 아데노신 삼인산(ATP)을 생성함으로써 세포 에너지 대사에 중요한 역할을 합니다. 특히 정자(spermatozoa)의 경우, ATP(해당과정 대 OXPHOS)의 출처에 대한 논란이 있으며, 많은 데이터가 논란의 여지가 있으며 다른 실험적 접근법에 의존하고있다 4,12,13. 산소 측정에 의한 호흡 측정은 미토콘드리아 호흡 능력, 미토콘드리아 무결성 및 세포의 에너지 대사에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다14,15,16. 전통적으로 이 기술은 50년 이상 미토콘드리아 호흡을 측정하는 데 사용되어 온 기기인 Clark 산소 전극을 사용하여 수행되었습니다17,18. 또한, 정자 미토콘드리아 산소 소비량은 고전적인 Clark 산소 전극 19,20,21을 사용하여 분석되었습니다. 산소 그래프(Oroboros)를 사용하는 고분해능 호흡 측정법(HRR)은 기존의 호흡 측정 장치를 사용하는 것보다 더 높은 감도를 제공한다22. 산소 그래프는 주입 포트가 있는 두 개의 챔버로 구성되며 각 챔버에는 폴라로그래픽 산소 센서가 있습니다. 이 기술을 사용하면 조직 슬라이드, 세포 및 분리된 미토콘드리아 현탁액을 분석할 수 있습니다. 표본은 챔버에서 지속적으로 교반되고 실험 중에 산소 소비량이 측정되고 특정 소프트웨어를 사용하여 산소 비율이 계산됩니다. 챔버는 감소된 산소 누출을 보여주는데, 이는 종래의 산소 전극 장치(14,23)에 비해 장점이다.
다른 세포와 마찬가지로 정자의 경우 HRR 장비의 감도가 기존 호흡기 측정보다 높기 때문에 HRR 장비는 제한된 수의 온전하거나 투과된 정자 세포의 분석에 사용할 수 있습니다. HRR에 의한 정자 미토콘드리아 기능 평가에는 두 가지 주요 전략이 있습니다: (a) 포도당과 같은 기질을 포함하는 배지에서 호흡 기능을 재현하는 온전한 세포의 산소 소비량을 측정하거나, (b) 각 기능을 개별적으로 모니터링하기 위해 특정 기질을 추가하여 OXPHOS 복합체 중 하나를 사용하여 투과된 세포의 산소 소비량을 측정합니다.
본 연구에서는 인간 정자 세포의 미토콘드리아 호흡을 결정하기 위해 HRR을 사용하는 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
HRR은 (a) 장비 유지보수, (b) 산소 센서의 정확한 교정, (c) 언커플러 적정(26), 그리고 마지막으로 (d) 미토콘드리아 기능을 나타내는 지수의 적절한 사용과 같은 몇 가지 단계에 따라 결정적으로 달라집니다. 장비 유지 보수는 매우 중요합니다. 폴라로그래픽 산소 센서의 멤브레인을 정기적으로 교체하고 기기 배경을 수정하는 것이 좋습니다. 챔버에서 정자를 채취 한 후 광범위한 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
기증자를 만날 수 있게 해주신 Fertilab Andrology 클리닉, 특히 José María Montes와 Andrea Torrents에게 감사드립니다. 자금 지원: A.C.는 Universidad de la República(CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021)의 보조금으로 지원됩니다. 추가 자금은 Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas(우루과이 PEDECIBA)에서 받았습니다. PI 및 RS 지원은 Universidad de la República (I+D, CSIC 2014; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 및 FMV_1_2017_1_136490 ANII- 우루과이). PI는 POS_FMV_2018_1_1007814 및 CAP-UDELAR 2020에서 지원됩니다. 수치는 Biorender.com 를 사용하여 설명되었습니다.
Materials
| Acid free- Bovine serum albumine | Sigma Aldrich | A8806 | |
| Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma Aldrich | A5285 | |
| Animycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
| carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | |
| DatLab sofware version 4,2 | Oroboros Instruments GmbH | N/A | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| L glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
| L malic acid | Sigma Aldrich | M1000 | |
| Magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Microliter Syringes | Hamilton | 87900 or 80400 | |
| Microscope camera | Basler | acA780-75gc | |
| Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+ | Nikon | N/A | |
| Monopotassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | |
| MOPS | Sigma Aldrich | M1254 | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Oxygraph-2 K | Oroboros Instruments GmbH | N/A | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Power O2k-Respirometer | Oroboros Intruments | 10033-01 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Sodium lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | |
| Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research | Microptic | N/A | |
| Sperm Counting Chamber DRM-600 | Millennium Sciences CELL-VU | N/A | |
| Succinate disodium salt | Sigma Aldrich | W327700 |
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