Analysen av sperm mitokondriell funksjon ved høyoppløselig respirometri tillater måling av oksygenforbruket av fritt bevegelige spermatozoer i et lukket kammersystem. Teknikken kan brukes til å måle respirasjon i humane spermatozoer, som gir informasjon om sperm mitokondrielle egenskaper og integritet.
Sædkvalitet studeres ofte ved rutinemessig sædanalyse, som er beskrivende og ofte mangelfull. Mannlig infertilitet er assosiert med endret sperm mitokondriell aktivitet, så måling av sperm mitokondriell funksjon er en indikator på sædkvalitet. Høyoppløselig respirometri er en metode for å måle oksygenforbruket til celler eller vev i et lukket kammersystem. Denne teknikken kan implementeres for å måle respirasjon i menneskelig sæd og gir informasjon om kvaliteten og integriteten til sædmitokondriene. Høyoppløselig respirometri gjør at cellene kan bevege seg fritt, noe som er en a priori fordel når det gjelder sædceller. Denne teknikken kan brukes med intakte eller permeabiliserte spermatozoer og muliggjør studier av intakt sæd, mitokondriell funksjon og aktiviteten til individuelle respiratoriske kjedekomplekser. Det høyoppløselige oksygrafinstrumentet bruker sensorer til å måle oksygenkonsentrasjonen kombinert med sensitiv programvare for å beregne oksygenforbruket. Dataene brukes til å beregne respiratoriske indekser basert på oksygenforbruksforholdene. Følgelig er indeksene proporsjonene av to oksygenforbrukshastigheter og er internt normalisert til cellenummer eller proteinmasse. Respiratoriske indekser er en indikator på sperm, mitokondriell funksjon og dysfunksjon.
Mannlig infertilitet er estimert til å utgjøre 40% -50% av alle tilfeller av infertilitet hos par1. Konvensjonell sædanalyse spiller en avgjørende rolle for å bestemme mannlig fruktbarhet; Imidlertid har omtrent 15% av infertile menn normale sædparametere2. I tillegg gir rutinemessig sædanalyse begrenset informasjon om sædfunksjon og gjenspeiler ikke subtile sæddefekter3.
Sperm mitokondrier har en spesiell struktur, da de er arrangert som en spiralformet skjede rundt flagellaen. Mitokondrieskjeden inneholder et variabelt antall mitokondrier forbundet med intermitokondrielle linkere og forankret til cytoskjelettet ved bestilte proteinarrangementer på den ytre mitokondriemembranen 4,5. Denne strukturen gjør det spesielt vanskelig å isolere sperm mitokondrier. Derfor bruker de fleste studier av sperm mitokondriell funksjon in situ analyser eller demembranert sperm6.
Sperm mitokondriell struktur og funksjon har vært konsekvent knyttet til mannlig infertilitet 7,8,9,10,11, noe som tyder på at analyse av strukturen og funksjonen til disse organellene kan være en god kandidat for inkludering i sædanalyse.
Mitokondrier spiller en viktig rolle i cellulær energimetabolisme, spesielt ved å bruke oksygen til å produsere adenosintrifosfat (ATP) gjennom oksidativ fosforylering (OXPHOS). Spesielt i spermatozoa er kilden til ATP (glykolyse vs. OXPHOS) omstridt, og mye av dataene forblir kontroversielle og avhenger av forskjellige eksperimentelle tilnærminger 4,12,13. Målinger av respirasjon ved oksymetri gir betydelig innsikt i mitokondriell respiratorisk kapasitet, mitokondriell integritet og energimetabolisme i cellen14,15,16. Tradisjonelt har denne teknikken blitt utført ved hjelp av Clark oksygenelektrode – et instrument som har blitt brukt til å måle mitokondriell respirasjon i mer enn 50 år17,18. I tillegg har sperm mitokondrielt oksygenforbruk blitt analysert ved hjelp av den klassiske Clark oksygenelektroden 19,20,21. Høyoppløselig respirometri (HRR) ved bruk av oksygrafer (Oroboros) gir høyere sensitivitet enn ved bruk av klassiske respirometrienheter22. Oksygrafene består av to kamre med injeksjonsporter, og hvert kammer har en polarografisk oksygensensor. Med denne teknikken er det mulig å analysere vevslysbilder, celler og isolerte mitokondrielle suspensjoner. Prøven omrøres kontinuerlig i kammeret, og under forsøket måles oksygenforbruket, og oksygenhastigheten beregnes ved hjelp av spesifikk programvare. Kamrene viser redusert oksygenlekkasje, noe som er en fordel i forhold til de konvensjonelle oksygenelektrodeenhetene14,23.
Som med andre celler, når det gjelder spermatozoer, er følsomheten til HRR-utstyr høyere enn for konvensjonell respirometri, noe som betyr at HRR-utstyr kan brukes til analyse av et begrenset antall intakte eller permeabiliserte sædceller. Det er to hovedstrategier for å vurdere sperm mitokondriell funksjon ved HRR: (a) måling av oksygenforbruket i intakte celler, som innebærer å reprodusere respiratorisk funksjon i et medium som inneholder substrater som glukose, eller (b) måle oksygenforbruket i permeabiliserte celler ved hjelp av et av OXPHOS-kompleksene, med tilsetning av spesifikke substrater for å overvåke hver funksjon separat.
I denne studien beskriver vi bruken av HRR for å bestemme mitokondriell respirasjon i humane sædceller.
HRR avhenger kritisk av flere trinn: (a) vedlikehold av utstyret, (b) nøyaktig kalibrering av oksygensensorene, (c) uncoupler-titrering26, og til slutt (d) tilstrekkelig bruk av indekser som representerer mitokondriefunksjonen. Vedlikehold av utstyr er avgjørende. Det anbefales å bytte ut membranene til den polarografiske oksygensensoren regelmessig og korrigere instrumentbakgrunnen. Omfattende vask etter samling av spermatozoa fra kamrene er avgjørende for å oppnå gode replikater, spesielt …
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Fertilab Andrology klinikken, spesielt José María Montes og Andrea Torrents, for å gi oss tilgang til givere. Finansiering: AC støttes av tilskudd fra Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021). Ytterligere finansiering ble hentet fra Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Uruguay). P.I. og R.S. støttes av Universidad de la República (I+D, CSIC 2014; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 og FMV_1_2017_1_136490 ANII- Uruguay). PI støttes av POS_FMV_2018_1_1007814 og CAP-UDELAR 2020. Figurene er illustrert med Biorender.com.
Acid free- Bovine serum albumine | Sigma Aldrich | A8806 | |
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma Aldrich | A5285 | |
Animycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | |
DatLab sofware version 4,2 | Oroboros Instruments GmbH | N/A | |
D-glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
L glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
L malic acid | Sigma Aldrich | M1000 | |
Magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
Microliter Syringes | Hamilton | 87900 or 80400 | |
Microscope camera | Basler | acA780-75gc | |
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+ | Nikon | N/A | |
Monopotassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | |
MOPS | Sigma Aldrich | M1254 | |
Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
Oxygraph-2 K | Oroboros Instruments GmbH | N/A | |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
Power O2k-Respirometer | Oroboros Intruments | 10033-01 | |
Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
Saccharose | Sigma Aldrich | S0389 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
Sodium lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | |
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research | Microptic | N/A | |
Sperm Counting Chamber DRM-600 | Millennium Sciences CELL-VU | N/A | |
Succinate disodium salt | Sigma Aldrich | W327700 |