Høyoppløselig respirometri for å vurdere mitokondriell funksjon i humane spermatozoer

Summary

Analysen av sperm mitokondriell funksjon ved høyoppløselig respirometri tillater måling av oksygenforbruket av fritt bevegelige spermatozoer i et lukket kammersystem. Teknikken kan brukes til å måle respirasjon i humane spermatozoer, som gir informasjon om sperm mitokondrielle egenskaper og integritet.

Abstract

Sædkvalitet studeres ofte ved rutinemessig sædanalyse, som er beskrivende og ofte mangelfull. Mannlig infertilitet er assosiert med endret sperm mitokondriell aktivitet, så måling av sperm mitokondriell funksjon er en indikator på sædkvalitet. Høyoppløselig respirometri er en metode for å måle oksygenforbruket til celler eller vev i et lukket kammersystem. Denne teknikken kan implementeres for å måle respirasjon i menneskelig sæd og gir informasjon om kvaliteten og integriteten til sædmitokondriene. Høyoppløselig respirometri gjør at cellene kan bevege seg fritt, noe som er en a priori fordel når det gjelder sædceller. Denne teknikken kan brukes med intakte eller permeabiliserte spermatozoer og muliggjør studier av intakt sæd, mitokondriell funksjon og aktiviteten til individuelle respiratoriske kjedekomplekser. Det høyoppløselige oksygrafinstrumentet bruker sensorer til å måle oksygenkonsentrasjonen kombinert med sensitiv programvare for å beregne oksygenforbruket. Dataene brukes til å beregne respiratoriske indekser basert på oksygenforbruksforholdene. Følgelig er indeksene proporsjonene av to oksygenforbrukshastigheter og er internt normalisert til cellenummer eller proteinmasse. Respiratoriske indekser er en indikator på sperm, mitokondriell funksjon og dysfunksjon.

Introduction

Mannlig infertilitet er estimert til å utgjøre 40% -50% av alle tilfeller av infertilitet hos par¹. Konvensjonell sædanalyse spiller en avgjørende rolle for å bestemme mannlig fruktbarhet; Imidlertid har omtrent 15% av infertile menn normale sædparametere². I tillegg gir rutinemessig sædanalyse begrenset informasjon om sædfunksjon og gjenspeiler ikke subtile sæddefekter³.

Sperm mitokondrier har en spesiell struktur, da de er arrangert som en spiralformet skjede rundt flagellaen. Mitokondrieskjeden inneholder et variabelt antall mitokondrier forbundet med intermitokondrielle linkere og forankret til cytoskjelettet ved bestilte proteinarrangementer på den ytre mitokondriemembranen ^4,5. Denne strukturen gjør det spesielt vanskelig å isolere sperm mitokondrier. Derfor bruker de fleste studier av sperm mitokondriell funksjon in situ analyser eller demembranert sperm⁶.

Sperm mitokondriell struktur og funksjon har vært konsekvent knyttet til mannlig infertilitet 7,8,9,10,11^, noe som tyder på at analyse av strukturen og funksjonen til disse organellene kan være en god kandidat for inkludering i sædanalyse.

Mitokondrier spiller en viktig rolle i cellulær energimetabolisme, spesielt ved å bruke oksygen til å produsere adenosintrifosfat (ATP) gjennom oksidativ fosforylering (OXPHOS). Spesielt i spermatozoa er kilden til ATP (glykolyse vs. OXPHOS) omstridt, og mye av dataene forblir kontroversielle og avhenger av forskjellige eksperimentelle tilnærminger 4,12,13. Målinger av respirasjon ved oksymetri gir betydelig innsikt i mitokondriell respiratorisk kapasitet, mitokondriell integritet og energimetabolisme i cellen^14,15,16. Tradisjonelt har denne teknikken blitt utført ved hjelp av Clark oksygenelektrode – et instrument som har blitt brukt til å måle mitokondriell respirasjon i mer enn 50 år^17,18. I tillegg har sperm mitokondrielt oksygenforbruk blitt analysert ved hjelp av den klassiske Clark oksygenelektroden 19,20,21. Høyoppløselig respirometri (HRR) ved bruk av oksygrafer (Oroboros) gir høyere sensitivitet enn ved bruk av klassiske respirometrienheter²². Oksygrafene består av to kamre med injeksjonsporter, og hvert kammer har en polarografisk oksygensensor. Med denne teknikken er det mulig å analysere vevslysbilder, celler og isolerte mitokondrielle suspensjoner. Prøven omrøres kontinuerlig i kammeret, og under forsøket måles oksygenforbruket, og oksygenhastigheten beregnes ved hjelp av spesifikk programvare. Kamrene viser redusert oksygenlekkasje, noe som er en fordel i forhold til de konvensjonelle oksygenelektrodeenhetene^14,23.

Som med andre celler, når det gjelder spermatozoer, er følsomheten til HRR-utstyr høyere enn for konvensjonell respirometri, noe som betyr at HRR-utstyr kan brukes til analyse av et begrenset antall intakte eller permeabiliserte sædceller. Det er to hovedstrategier for å vurdere sperm mitokondriell funksjon ved HRR: (a) måling av oksygenforbruket i intakte celler, som innebærer å reprodusere respiratorisk funksjon i et medium som inneholder substrater som glukose, eller (b) måle oksygenforbruket i permeabiliserte celler ved hjelp av et av OXPHOS-kompleksene, med tilsetning av spesifikke substrater for å overvåke hver funksjon separat.

I denne studien beskriver vi bruken av HRR for å bestemme mitokondriell respirasjon i humane sædceller.

Protocol

Eksperimentene ble godkjent av etikkomiteen ved Facultad de Medicina de la Universidad de la República, Montevideo, Uruguay. Figur 1: Arbeidsflyt for høyoppløselig respirometri for å vurdere mitokondriefunksjon i intakt og permeabilisert human sæd. Protokollen ble delt inn i fire ulike trinn: 1) klargjøring av prøv…

Representative Results

Bestemmelse av optimal konsentrasjon av digitonin i sædcellerI denne protokollen presenterer vi bruken av HRR for å overvåke sanntidsendringer i OXPHOS i humane sædceller. Siden metoden kan brukes til å analysere intakt eller digitoninpermeabilisert sæd, presenterer vi først standardiseringen av digitoninkonsentrasjon som kreves for å permeabilisere sædceller (figur 3). Digitonin brukes til kjemisk permeabilisering, som gjør at subst…

Discussion

HRR avhenger kritisk av flere trinn: (a) vedlikehold av utstyret, (b) nøyaktig kalibrering av oksygensensorene, (c) uncoupler-titrering²⁶, og til slutt (d) tilstrekkelig bruk av indekser som representerer mitokondriefunksjonen. Vedlikehold av utstyr er avgjørende. Det anbefales å bytte ut membranene til den polarografiske oksygensensoren regelmessig og korrigere instrumentbakgrunnen. Omfattende vask etter samling av spermatozoa fra kamrene er avgjørende for å oppnå gode replikater, spesielt …

Materials

Acid free- Bovine serum albumine	Sigma Aldrich	A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma Aldrich	A5285
Animycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920
DatLab sofware version 4,2	Oroboros Instruments GmbH	N/A
D-glucose	Sigma Aldrich	G7021
Digitonin	Sigma Aldrich	D141
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
L glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L malic acid	Sigma Aldrich	M1000
Magnesium sulphate	Sigma Aldrich	M7506
Microliter Syringes	Hamilton	87900 or 80400
Microscope camera	Basler	acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+	Nikon	N/A
Monopotassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
MOPS	Sigma Aldrich	M1254
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Oxygraph-2 K	Oroboros Instruments GmbH	N/A
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911
Power O2k-Respirometer	Oroboros Intruments	10033-01
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sodium lactate	Sigma Aldrich	L7022
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research	Microptic	N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600	Millennium Sciences CELL-VU	N/A
Succinate disodium salt	Sigma Aldrich	W327700