Респирометрия высокого разрешения для оценки функции митохондрий в сперматозоидах человека

Summary

Анализ митохондриальной функции сперматозоидов с помощью респирометрии высокого разрешения позволяет измерять потребление кислорода свободно движущимися сперматозоидами в замкнутой камере. Метод может быть применен для измерения дыхания в сперматозоидах человека, что дает информацию о митохондриальных характеристиках и целостности сперматозоидов.

Abstract

Качество спермы часто изучается с помощью рутинного анализа спермы, который является описательным и часто неубедительным. Мужское бесплодие связано с измененной митохондриальной активностью сперматозоидов, поэтому измерение митохондриальной функции сперматозоидов является показателем качества спермы. Респирометрия высокого разрешения — это метод измерения потребления кислорода клетками или тканями в системе с закрытой камерой. Этот метод может быть применен для измерения дыхания в сперматозоидах человека и предоставляет информацию о качестве и целостности митохондрий сперматозоидов. Респирометрия с высоким разрешением позволяет клеткам свободно двигаться, что является априорным преимуществом в случае сперматозоидов. Этот метод может применяться с интактными или пермеабилизированными сперматозоидами и позволяет исследовать интактную функцию митохондрий сперматозоидов и активность отдельных комплексов дыхательной цепи. Оксиграф высокого разрешения использует датчики для измерения концентрации кислорода в сочетании с чувствительным программным обеспечением для расчета потребления кислорода. Полученные данные используются для расчета дыхательных индексов на основе коэффициентов потребления кислорода. Следовательно, индексы представляют собой пропорции двух скоростей потребления кислорода и внутренне нормируются к количеству клеток или массе белка. Дыхательные индексы являются индикатором митохондриальной функции и дисфункции сперматозоидов.

Introduction

По оценкам, мужское бесплодие составляет 40-50% всех случаев бесплодия в парах¹. Обычный анализ спермы играет решающую роль в определении мужской фертильности; Тем не менее, примерно 15% бесплодных мужчин имеют нормальные параметры сперматозоидов². Кроме того, рутинный анализ спермы дает ограниченную информацию о функции сперматозоидов и не отражает малозаметные дефекты сперматозоидов³.

Митохондрии сперматозоидов имеют особое строение, так как расположены в виде спиральной оболочки вокруг жгутиков. Митохондриальная оболочка содержит переменное число митохондрий, соединенных межмитохондриальными линкерами и закрепленных в цитоскелете упорядоченными белковыми расположениями на внешней митохондриальной мембране ^4,5. Такая структура особенно затрудняет выделение митохондрий сперматозоидов. Поэтому в большинстве исследований митохондриальной функции сперматозоидов используют анализ in situ или демембрированных сперматозоидов⁶.

Митохондриальная структура и функции сперматозоидов последовательно связаны с мужским бесплодием 7,8,9,10,11, что позволяет предположить^, что анализ структуры и функции этих органелл может быть хорошим кандидатом для включения в анализ спермы.

Митохондрии играют важную роль в клеточном энергетическом метаболизме, в частности, используя кислород для производства аденозинтрифосфата (АТФ) путем окислительного фосфорилирования (OXPHOS). В сперматозоидах, в частности, источник АТФ (гликолиз против OXPHOS) является спорным, и большая часть данных остается спорной и зависит от различных экспериментальных подходов 4,12,13. Измерения дыхания с помощью оксиметрии дают важное представление о дыхательной способности митохондрий, целостности митохондрий и энергетическом метаболизме клетки^14,15,16. Традиционно этот метод выполнялся с использованием кислородного электрода Кларка – прибора, который использовался для измерения митохондриального дыхания более 50^лет. Кроме того, было проанализировано потребление кислорода митохондриями сперматозоидов с помощью классического кислородного электрода Кларка ^19,20,21. Респирометрия высокого разрешения (HRR) с использованием оксиграфов (Oroboros) обеспечивает более высокую чувствительность, чем использование классических респирометрических приборов²². Оксиграфы состоят из двух камер с инжекционными портами, и каждая камера оснащена полярографическим датчиком кислорода. С помощью этого метода можно анализировать тканевые слайды, клетки и изолированные митохондриальные суспензии. Образец непрерывно перемешивается в камере, и во время эксперимента измеряется потребление кислорода, а скорость кислорода рассчитывается с помощью специального программного обеспечения. Камеры демонстрируют пониженную утечку кислорода, что является преимуществом по сравнению с обычными кислородными электродными устройствами ^14,23.

Как и в случае с другими клетками, в случае сперматозоидов чувствительность оборудования HRR выше, чем для обычной респирометрии, что означает, что оборудование HRR может быть использовано для анализа ограниченного количества интактных или пермеабилизированных сперматозоидов. Существует две основные стратегии оценки митохондриальной функции сперматозоидов с помощью HRR: (а) измерение потребления кислорода в интактных клетках, которое включает воспроизведение дыхательной функции в среде, содержащей субстраты, такие как глюкоза, или (б) измерение потребления кислорода в пермеабилизированных клетках с использованием одного из комплексов OXPHOS с добавлением специфических субстратов для мониторинга каждой функции отдельно.

В настоящем исследовании мы описываем использование HRR для определения митохондриального дыхания в сперматозоидах человека.

Protocol

Эксперименты были одобрены Комитетом по этике Медицинского факультета Университета Республики в Монтевидео, Уругвай. Рисунок 1: Рабочий процесс для респирометрии высокого разреше…

Representative Results

Определение оптимальной концентрации дигитонина в сперматозоидахВ этом протоколе мы представляем использование HRR для мониторинга изменений OXPHOS в сперматозоидах человека в режиме реального времени. Поскольку метод может быть использован для анализа интактных или дигито?…

Discussion

HRR критически зависит от нескольких этапов: (а) техническое обслуживание оборудования, (б) точная калибровка датчиков кислорода, (в) титрование развязки²⁶ и, наконец, (г) адекватное использование индексов, представляющих митохондриальную функцию. Техническое обслуживание об?…

Materials

Acid free- Bovine serum albumine	Sigma Aldrich	A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma Aldrich	A5285
Animycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920
DatLab sofware version 4,2	Oroboros Instruments GmbH	N/A
D-glucose	Sigma Aldrich	G7021
Digitonin	Sigma Aldrich	D141
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
L glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L malic acid	Sigma Aldrich	M1000
Magnesium sulphate	Sigma Aldrich	M7506
Microliter Syringes	Hamilton	87900 or 80400
Microscope camera	Basler	acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+	Nikon	N/A
Monopotassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
MOPS	Sigma Aldrich	M1254
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Oxygraph-2 K	Oroboros Instruments GmbH	N/A
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911
Power O2k-Respirometer	Oroboros Intruments	10033-01
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sodium lactate	Sigma Aldrich	L7022
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research	Microptic	N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600	Millennium Sciences CELL-VU	N/A
Succinate disodium salt	Sigma Aldrich	W327700