Her presenterer vi en protokoll for utvikling og validering av god laboratoriepraksis i kompatibel påvisning av adeno-assosierte virale vektorer i humane tårer ved dråpe digital polymerasekjedereaksjon til støtte for klinisk utvikling av genterapivektorer.
Bruken av virale vektorer for å behandle genetiske sykdommer har økt betydelig de siste årene, med over 2000 studier registrert til dags dato. Adeno-associated viral (AAV) vektorer har funnet særlig suksess i behandlingen av øyerelaterte sykdommer, som eksemplifisert ved godkjenning av voretigene neparvovec-rzyl. For å bringe nye terapier til markedet, ber reguleringsorganer vanligvis om kvalifiserte eller validerte biosheddingstudier for å evaluere frigjøring av vektoren i miljøet. Imidlertid har ingen offisielle retningslinjer for utvikling av molekylære baserte analyser for å støtte slike shedding studier blitt utgitt av USA Food and Drug Administration, slik at utviklere kan bestemme beste praksis for seg selv. Formålet med denne protokollen er å presentere en validerbar protokoll for påvisning av AAV-vektorer i humane rifter ved dråpedigital polymerasekjedereaksjon (ddPCR) til støtte for kliniske biosheddingstudier. Dette manuskriptet diskuterer dagens industrielle tilnærminger til molekylær analysevalidering og demonstrerer at metoden overgår akseptkriteriene for målanalysen som for tiden foreslås i hvitbøker. Til slutt diskuteres trinn som er kritiske i utførelsen av enhver ddPCR-analyse, uavhengig av applikasjon.
Genterapidefinisjoner varierer, men induserer generelt en forsettlig og ofte forventet permanent veksling av en spesifikk DNA-sekvens av det cellulære genomet for å modifisere eller manipulere uttrykket av et gen eller for å endre de biologiske egenskapene til en levende celle for et klinisk formål 1,2. Virale vektorer blir i økende grad brukt som kjøretøy for genterapi på grunn av deres effektivitet av transduksjon, med en rapport som tyder på at over 70% av dagens kliniske genterapistudier bruker virale vektorer3. Interessen for virale vektorer for genterapi har økt jevnt. Kvartal 4 2022 kvartalsvis datarapport om gen-, celle- og RNA-terapilandskapet fra American Society of Gene and Cell Therapy rapporterte at i 2022 vokste gen-, celle- og RNA-terapirørledningen fra preklinisk til forhåndsregistrering med 7%, noe som brakte det totale antallet terapier under utvikling til 3,726, hvorav 2,053 (55%) var genterapier4. USA Food and Drug Administration (USA FDA) har for tiden godkjent 27 celle- og genterapier for klinisk bruk hos mennesker, hvorav fem spesifikt bruker virale vektorer5.
Adenoassosierte virus (AAV) har fått spesiell interesse som redskap for genterapi. En fersk metaanalyse viste at det har vært omtrent 136 kliniske studier som undersøker bruken av AAVs de siste to tiårene6. I tillegg er tre av de fem USA-godkjente genterapiene AAV-basert. Dette skyldes deres svært redigerbare natur, brede vertsområde som kan justeres basert på bruk av spesifikke naturlig forekommende eller kunstig konstruerte vektorer, lav patogenisitet og toksisitet hos mennesker, og generelt lav immunogenisitet 7,8. AAV har også med hell blitt brukt til å behandle øyesykdommer i en godkjent klinisk setting. Voretigene neparvovec-rzyl er en AAV2-basert terapi som ble godkjent av USAs FDA i 2017 og av European Medicines Agency (EMA) i 2018 for å behandle biallelisk RPE65-mutasjonsassosiert retinal dystrofi9.
Med økende interesse for utvikling av AAV-baserte terapier kommer behovet for regulatorisk veiledning på analyser. Nøyaktig påvisning og kvantifisering av enhver viral vektor er en integrert del av oppdagelsen, produksjonen og prekliniske/kliniske testfaser av produktutviklingen. USAs FDA har begynt å utstede noen veiledning for genterapier, blant annet om kjemi, produksjon og kontroll for human genterapiundersøkelsesapplikasjoner 10, langsiktig oppfølging etter administrering av genterapi 11, replikasjonskompetent retrovirustesting12 og anbefalinger for mikrobielle vektorer som brukes i genterapier 13. EMA har også gitt ut en rekke retningslinjer for utvikling av genterapiprodukter som generelt samsvarer med FDA-anbefalingene, selv om noen forskjeller eksisterer14. Det er viktig å merke seg at selv om disse retningslinjene ikke etablerer juridisk håndhevbare ansvar, bortsett fra der spesifikke forskrifter er referert, gir de klarhet i gjeldende tenkning fra reguleringsorganer om emnet og deres forventninger til analyser som kreves for narkotikaregistreringer og regulatorisk godkjenning.
FDA anbefaler spesifikt at studier bør utføres for å vurdere distribusjon, utholdenhet og clearance av en vektor fra administrasjonsstedet for å målrette okulært og ikke-okulært vev, intraokulære væsker og blod15. Disse tar form av biodistribusjon og shedding studier. Biodistribusjonsstudier evaluerer eksponering ved å undersøke hvordan et produkt spres gjennom en pasients kropp fra administrasjonsstedet. Shedding evaluerer spesifikt frigjøringen av produktet fra pasienten til miljøet og øker muligheten for overføring av vektoren til ubehandlede individer16. FDA gir anbefalinger for utforming av biodistribusjon og shedding studier med hensyn til hyppigheten av prøveinnsamling, varighet av prøveinnsamling, typer prøver samlet, og lagringsforhold.
I tillegg anbefaler FDA bruk av kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR, eller sanntids PCR) for kvantitativ påvisning av vektorgenomer på grunn av sin enkle ytelse, høyt gjennomstrømningsformat, raske behandlingstider og analysefølsomhet. Det er imidlertid en relativ mangel på anbefalinger for design og ytelsesvurdering av molekylære metoder sammenlignet med de som finnes for små og store molekyler. Mange av retningslinjene for slike studier er vanskelige å anvende på molekylære metoder på grunn av den unike og komplekse utformingen av både produktene og analysene selv, noe som reiser spørsmål om hensiktsmessigheten av de tilgjengelige plattformene for de anbefalte vurderingene og passende metoder for analysevalidering. Til dags dato har FDA ikke krevd formell validering av PCR-baserte analyser, selv om EMA har pålagt dette kravet17. I lys av dette tomrommet har ulike grupper og workshops utstedt stortingsmeldinger og anbefalinger som produsenter og oppdragsforskningsorganisasjoner har søkt å følge 18,19,20,21,22,23,24,25. De fleste av disse anbefalingene er skrevet spesifikt med qPCR-analyser i tankene, med forslag eller endringer for nye plattformer, for eksempel dråpedigital PCR (ddPCR), inkludert bare som anses relevant. Nyere anbefalinger har fokusert på hensyn til ddPCR-analyser, men har i stor grad fokusert på deres anvendelser på vektorgenomkvantifisering i en produksjonsinnstilling i stedet for i de komplekse biologiske matrisene som oppstår i biosheddingstudier.
Avhengig av klinisk anvendelse og mål, kan ddPCR foretrekkes fremfor qPCR til støtte for biodistribusjons- og utskillingsstudier på grunn av ddPCRs økte sensitivitet og evne til å håndtere matriksinterferens sammenlignet med qPCR. På grunn av oppdelingen av prøvene i ca. 20 000 dråper, kan man dessuten oppnå nøyaktig kvantifisering av kopinummeret uten bruk av en standardkurve ved hjelp av Poisson-statistikk, noe som forenkler metodeutviklingen og valideringen. Målet med denne protokollen er å beskrive en standardisert tilnærming for utvikling og validering av en ddPCR-basert metode for påvisning av AAV-vektorer i tårer samlet inn fra den okulære overflaten til støtte for kliniske biosheddingstudier.
Det er flere trinn i ddPCR-protokollen som er avgjørende for riktig ytelse av analysen. Det første kritiske trinnet er design og optimalisering av primere og sonde. Generelt anbefales bruk av hydrolysesondebasert kjemi over fargestoffbasert kjemi (f.eks. SYBR Green) i en preklinisk eller klinisk setting på grunn av deres overlegne spesifisitet. I tillegg er valget av forsterkningsmål kritisk. Vanligvis er transgenet av interesse for vektoren målrettet. I tidligere prekliniske stadier eller i vektorer der det kanskje ikke er mulig å skille vektortransgen versus genomisk DNA, kan det imidlertid være hensiktsmessig å bruke standardiserte vektormål. For eksempel kan man målrette mot den inverterte terminalrepetisjonsregionen, promotoren, poly-A-halen eller kryssene mellom segmentene mellom disse vektorkomponentene. Valg av mål vil variere basert på vektordesign. Tradisjonelle qPCR-primer- og sondedesignstrategier og programvare er vanligvis passende for ddPCR. Designparametere som forventes å gi en konsistent glødetemperatur (for eksempel 60 °C), bør velges for å redusere mengden optimalisering som kreves. Det har også blitt anbefalt å designe, bestille og evaluere minst tre forskjellige sett for hvert mål. Man bør deretter velge settet som viser størst spesifisitet (ingen amplifikasjon i den negative kontrollbrønnen eller i en matrise av relatert mål-DNA) og sensitivitet (dvs. deteksjonsgrense)20.
Hvis det er fordelaktig å kunne overføre analysen mellom qPCR og ddPCR, anbefales det å optimalisere analyseforholdene ved hjelp av qPCR først, og å identifisere forhold for det valgte settet som resulterer i amplifikasjonseffektivitet på 90%-110% med en R2 ≥ 0,98. Imidlertid er ddPCR som en endepunktsmetode vanligvis mindre følsom enn qPCR på grunn av varianser i amplifikasjonseffektivitet. Som et minimum anbefales det å kjøre en termisk temperaturgradient i glødnings- / forlengelsestrinnet for å dekke temperaturer over og under de forventede glødetemperaturene og å evaluere regn- og fluorescerende amplitudeseparasjon mellom de negative og positive dråpeklyngene som en funksjon av temperaturen. Hvis arbeidsområdet tillater det, anbefales det å ha individuelle dedikerte arbeidsstasjoner for klargjøring av masterblanding, tillegg av maler og forsterkning. Der det er mulig, bør disse fysisk atskilles av en ensrettet arbeidsflyt med innebygde tekniske kontroller, for eksempel kontrollert tilgang og differensielt lufttrykk, for å redusere risikoen for krysskontaminering og falske positiver. Hvis dette ikke er mulig, må det utvises ekstrem forsiktighet for å forhindre krysskontaminering.
Det er to trinn i denne protokollen som kan virke uvanlige for de som er mer vant til utvikling av qPCR-analyser. Den første er inkluderingen av et restriksjonsenzym i PCR-masterblandingen. Under ddPCR-forsterkning termosykles hver dråpe til endepunktet. I en riktig optimalisert analyse resulterer dette i to populasjoner av dråper, ett sett som viser et konsekvent høyt nivå av fluorescerende signaler – de positive – og et annet som konsekvent viser et lavt nivå av fluorescerende signal – negativene. Hvis PCR-interferens oppstår, kan det desynkronisere initiering av PCR-amplifikasjon, noe som resulterer i at dråpen ikke når et forsterkningsplatå, og dermed inkonsistente fluorescerende endepunkter. I dette tilfellet vil dråpene fordeles mellom de negative og positive, noe som resulterer i et fenomen som kalles ddPCR-regn. Dette kan føre til unøyaktig kvantifisering av målet og inkonsekvente og subjektivt anvendte terskler. Vår anbefaling om å sette terskelen litt over signalet fra NTC, noe som bør minimere effekten av regn i den endelige kvantifiseringen, da alle dråper fortsatt anses som positive, selv om de ikke er fullt syklet til endepunktet. AAV-er har en svært kompleks sekundærstruktur som, avhengig av amplifikasjonsmålet, kan redusere tilgjengeligheten til primere og sonder, noe som resulterer i PCR-interferens og dermed regn. Inkluderingen av restriksjonsenzymet i masterblandingen spalter denne sekundære strukturen for å øke tilgangen til primere og sonder, redusere regnet, noe som dermed kan forbedre nøyaktigheten av analysen. Effektene av inkludering av et restriksjonsenzym i ddPCR-reaksjonen er beskrevet tidligere25,32. Ethvert restriksjonsenzym kan brukes, så lenge det er bekreftet å ikke kutte innenfor målamplifikasjonsområdet. Ingen forfordøyelsestrinn eller alternative buffersammensetninger er nødvendig.
Det andre uvanlige trinnet er fremstilling av tåreprøven som inneholder AAV. I denne protokollen ble et 1:10 (eller høyere) forhold mellom tårer benyttet og deretter ble prøven oppvarmet. Vanligvis, når tårer samles via et kapillærrør, som er en mye brukt oppsamlingsmetode, kan i gjennomsnitt ca. 10,0 μL samles33. Fortynningen bidrar til å håndtere det begrensede prøvevolumet og gir nok materiale til duplikatbrønntesting. Selv om dette reduserer den teoretiske deteksjonsgrensen, bør den robuste følsomheten til ddPCR fortsatt resultere i deteksjon av alle, men et ekstremt få antall vektorpartikler. Denne tilnærmingen skaper i tillegg en “backup” godt hvis man skulle uventet mislykkes. I dette tilfellet, eller i tilfeller med utilstrekkelig prøvevolum til å drive to brønner, kan Poisson-feilen brukes til å vurdere presisjonen. Videre, i tilfeller der konsentrasjonen er under deteksjonsgrensen, skaper det en mulighet til å slå sammen brønndata for å bestemme en konsentrasjon. Det er nødvendig å frigjøre AAV-vektorene fra viruskapsidene for ddPCR-deteksjon. Noen metoder for kvantifisering av AAV har inkludert et proteinase K-fordøyelsestrinn for å fjerne viruskapsid34,35,36. Alle naturlig forekommende AAV-serotyper har smeltetemperaturer på eller under ca. 90 °C, og de fleste faller under 80 °C. Derfor synes dette å være en unødvendig inkludering37. Oppvarming alene ser ut til å være tilstrekkelig til å frigjøre vektor-DNA.
Videre er ddPCR generelt mindre utsatt for PCR-hemmere som kan være tilstede i en prøve som kan påvirke en qPCR-analyse. Hvis et spesifikt DNA-isolasjonstrinn er inkludert, vil dette også kreve spesifikk validering, noe som unngås i denne protokollen. Prøvene fortynnes før oppvarming på grunn av kinetikken til diffusjon av vektorgenomene i en væske. Under oppvarming og påfølgende avkjølingsprosess kan de positive og negative sansestrengene i det enkeltstrengede DNA-genomet gløde sammen for å produsere et dobbeltstrenget mellomprodukt hvis konsentrasjonene er tilstrekkelig høye. Fortynning før oppvarming reduserer konsentrasjonene og gjør det matematisk usannsynlig at det dannes nok dobbeltstrengede mellomprodukter til å ha en negativ effekt på kvantifiseringens nøyaktighet. Det skal bemerkes at de syntetiske DNA-fragmentene eller lineariserte plasmider som brukes som kvalitetskontroller, ikke må gjennomgå dette oppvarmingstrinnet. Siden disse er dobbeltstrengede, vil oppvarming resultere i konvertering til enkeltstrengede mellomprodukter. Etter uavhengig partisjonering av disse enkeltstrengede QCene i dråper, forventes dette å resultere i en dobling i QC-konsentrasjonen i forhold til den nominelle konsentrasjonen. Alternativt, hvis QC skal varmes opp for å standardisere metoden, må dette tas med i rekonstitueringen og tildelingen av en nominell konsentrasjon.
Til slutt, med hensyn til prøvepreparering, anbefaler mange protokoller også inkludering av et DNase-behandlingstrinn for å fjerne uinnkapslet vektor-DNA. Dette trinnet er kritisk i tilfeller der det ikke er ønskelig å kvantifisere fritt DNA assosiert med vektorpreparatet (for eksempel under kvantifisering for doseringsformål). Men i sammenheng med biodistribusjon og bioshedding studier, ønsker man vanligvis å vite hvor noen vektor DNA har reist, uavhengig av om det er innkapslet eller ikke. Derfor anbefales det å vanligvis ikke utføre et DNase-behandlingstrinn under slike studier. Hvis det fastslås at det er nødvendig å inkludere et DNase-trinn, bør dette trinnet være før fortynning og oppvarming.
I denne artikkelen presenteres data som er representative for tilnærmingen til vurdering av metodens dynamiske område, følsomhet, nøyaktighet og presisjon innenfor rammen av en hensiktsmessig, god laboratoriepraksis-kompatibel validering. Den nåværende mangelen på veiledning om dette emnet etterlater validerende laboratorier for å bestemme målanalysekriterier for seg selv, i tråd med dagens bransjetenkning. Ulike grupper har stilt både høyere og lavere målkriterier enn brukt i denne studien: 19,20,21,22,23,24,25. Målanalysekriteriene, inntil de er strengere definert, bør velges før validering basert på de tiltenkte kliniske anvendelsene av metoden. Avhengig av nedstrømsbeslutningene som skal tas på grunnlag av dataene, kan det være behov for høyere nivåer av nøyaktighet og presisjon. Omvendt kan et enkelt positivt versus negativt resultat være tilstrekkelig.
Tilnærmingen omhandlet også anbefalinger for vurdering av spesifisitet og matriseeffekt. En pool av tårer samlet fra ubehandlede individer klarte ikke å gi et positivt resultat i denne analysen, mens målet kunne oppdages når vektoren ble pigget inn i tårene ved høy og lav konsentrasjon innenfor anbefalte utvinningsrater. Ideelt sett ville matriks som inneholder endogen vektor (f.eks. samlet inn etter behandling med viral vektor) også bli inkludert i disse vurderingene. Det er imidlertid lite sannsynlig at slike prøver vil være tilgjengelige for bruk i en validering. For å øke robustheten til valideringen, kan flere tårebassenger, eller tårer samlet fra en rekke individer, vurderes for å avgjøre om en pasientspesifikk matriseeffekt oppstår. Til slutt anbefales det å evaluere stabiliteten. I arbeidsflyter der DNA-ekstraksjon skjer ut av den biologiske matrisen, kan det være nødvendig å evaluere stabiliteten til både prøven og det ekstraherte DNA. I denne arbeidsflyten testes prøven direkte i analysen uten behov for DNA-ekstraksjon. Derfor, i betraktning av evalueringen av stabiliteten for denne metoden, må man vurdere stabiliteten til tårprøvene. Vanligvis anbefales benkeplate, kjøleskap, frysing/tining og langsiktige stabilitetsvurderinger. Disse ble ikke utført som en del av denne studien, men metodene som er utviklet her kan brukes i denne vurderingen, etter manipulasjoner til inngangsprøvene.
Samlet sett har denne metoden vist seg å være en robust, repeterbar og validerbar analyse for å oppdage AAV-baserte vektorer i tåreprøver. Det kan tjene som en plattform som skal tilpasses spesifikke vektorer for å støtte kliniske studier og gir grunnlag for validering av en analyse i samsvar med god laboratoriepraksis.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Nick Russell og Brandon McKethan fra Bio-Rad for deres nyttige diskusjoner under utviklingen av denne metoden.
AAV-eGFP Vector | Charles River Laboratories | RS-AAV2-FL | Lot AAV2-0720-FL, used as a proof of principle vector |
AutoDG Droplet Digital PCR system | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
AutoDG Oil for Probes | Bio-Rad | 1864110 | Or use material compatible with ddPCR system. |
ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad | 1863052 | Or use material compatible with ddPCR system and PCR chemistry. |
ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 1863004 | Or use material compatible with ddPCR system. |
ddPCR Piercable Foil Seals | Bio-Rad | 1814040 | Or use material compatible with ddPCR system. |
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad | 12001925 | Or use material compatible with ddPCR system. |
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863023, 1863024, or 1863025 | Use master mix compatible with primers/probes and ddPCR system. |
DG32 AutoDG Cartidges | Bio-Rad | 1864108 | Or use material compatible with ddPCR system. |
Droplet Reader | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
GeneAmp PCR Buffer | Applied Biosystems | N8080129 | N/A |
Nuclease-Free Water | Ambion | AM9906 | N/A |
PCR Plate Sealer | Bio-Rad | PX1 | Or use material compatible with ddPCR system. |
Pipet Tips for AutoDG | Bio-Rad | 1864120 | Or use material compatible with ddPCR system. |
Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant | Gibco | 24040 | N/A |
Primer and Hydrolysis Probes | Various | Various | Design based on target sequence using general approaches for primer/probe design. Select fluorphores and quenchers compatible with ddPCR system. |
Restriction Enzyme | Various | Various | Varies with target amplification sequence. Use restriction enzyme that does not cut in the amplified sequence |
Sheared salmon sperm DNA | ThermoFisher | AM9680 | N/A |
Synthetic DNA gene fragment or linearized plasmid | Various | Various | Design a synthetic DNA fragment containing the target amplification region for use as a quality control |
TE Buffer | Teknova | T0224 | Ensure prepared or purchases nuclease free. 10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH=8.0 |
Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | C1000 | Or use material compatible with ddPCR system. |