Denne forskning skitserer to teknikker til isolering af rigelige neutrofile ekstracellulære fælder (NET’er) fra rotteknoglemarv. Den ene metode kombinerer et kommercielt neutrofilisoleringssæt med densitetsgradientcentrifugering, mens den anden kun anvender densitetsgradientcentrifugering. Begge tilgange giver funktionelle NET’er, der overgår dem fra perifere blodneutrofiler.
Det primære mål med denne forskning var at udvikle en pålidelig og effektiv tilgang til isolering af neutrofile ekstracellulære fælder (NET’er) fra rotteknoglemarv. Denne indsats opstod på grund af begrænsninger forbundet med den traditionelle metode til ekstraktion af NET’er fra perifert blod, hovedsageligt på grund af manglen på tilgængelige neutrofiler til isolering. Undersøgelsen afslørede to forskellige metoder til opnåelse af rotteneutrofiler fra knoglemarv: en strømlinet ettrinsprocedure, der gav tilfredsstillende rensningsniveauer, og en mere tidskrævende totrinsproces, der udviste forbedret rensningseffektivitet. Det er vigtigt, at begge teknikker gav en betydelig mængde levedygtige neutrofiler, der spænder mellem 50 og 100 millioner pr. Rotte. Denne effektivitet afspejlede resultaterne opnået ved isolering af neutrofiler fra både humane og murinkilder. Signifikant udviste neutrofiler afledt af rotteknoglemarv sammenlignelige evner til at udskille NET’er sammenlignet med neutrofiler opnået fra perifert blod. Den knoglemarvsbaserede metode producerede imidlertid konsekvent betydeligt større mængder af både neutrofiler og NET’er. Denne tilgang demonstrerede potentialet til at opnå betydeligt større mængder af disse cellulære komponenter til yderligere downstream-applikationer. Især disse isolerede NET’er og neutrofiler holder løfte om en række applikationer, der spænder over inflammation, infektion og autoimmune sygdomme.
Neutrofiler udgør en kritisk delmængde af leukocytter, der spiller en afgørende rolle i det medfødte immunrespons. De er kendetegnet ved multilobede kerner og granulater indeholdende forskellige proteaser og antimikrobielle peptider1. Neutrofiler fungerer primært gennem degranulering, fagocytose og dannelse af NET’er. Observationen af NETs blev først foretaget af Takei et al. i 1996 under et eksperiment, hvor neutrofiler blev stimuleret med phorbolmyristatacetat (PMA)2. Derefter blev processen med NET-dannelse opfundet “NETosis” af Brinkmann et al.3 i 2004. Deres forskning belyste yderligere NETs afgørende rolle i neutrofilmedierede antimikrobielle responser. NETs er weblignende strukturer sammensat af kromatin, histoner og antimikrobielle proteiner, der frigives fra aktiverede neutrofiler som reaktion på infektiøse og inflammatoriske stimuli. NETs kan immobilisere og dræbe invaderende patogener ved at fange dem og udsætte dem for en høj koncentration af antimikrobielle peptider og proteaser 1,3. Derudover bidrager NETs til clearance af apoptotiske celler og deltager i inflammationsopløsning. Nylige undersøgelser viser også, at overdreven dannelse af NETs eller nedsat netnedbrydning kan føre til vævsskade, autoimmune lidelser, trombogenese og nedsat revaskularisering 4,5,6,7,8,9,10.
NETs patogene rolle i ukontrolleret fibrose efter myokardieinfarkt og dannelsen af ventrikulære aneurismer er blevet påvist gennem udvidelsen af perivaskulær fibrose 4,11. Myokardieinfarktmodellen og isoleringen af neutrofiler fra knoglemarv hos mus er begge veletablerede. Polymorfonukleære (PMN) leukocytter, en type hvide blodlegemer, der er rigelige i humant blod, tjener som en fremragende kilde til isolering af humane neutrofiler. Denne metode eliminerer behovet for at høste knoglemarv og forbedrer dermed sikkerheden og effektiviteten.
NETs spiller også en rolle i atrieflimren forbundet med hjertemodellering. Imidlertid blev store dyr som hunde og svin brugt til at modellere atrieflimren, da mus mangler et atrium, der er stort nok til at etablere en genoptagelsescyklus eller AF-modellen, medmindre specifikke ionkanaler eller signalveje slås ned eller slås ud12. Mens det er muligt at inducere atrieflimren hos rotter og isolere neutrofiler fra rotte perifert blod som tidligere beskrevet, stødte forskerne på en begrænsning, hvorved kun 2 x 105-5 x 105 neutrofiler kunne isoleres fra perifert blod (10 ml pr. Rotte). Ekstraktion af tilstrækkelige NETs på hvert tidspunkt krævede ca. 10-25 rotter (5 x 106 neutrofiler i alt), hvilket resulterede i en tidskrævende, dyr og ofte lavt udbytteproces 13. I denne henseende præsenterer Li He og kolleger en knoglemarvsorienteret strategi for at opnå tilstrækkelige NET’er fra rotter14. I deres artikel giver de en omfattende beskrivelse af isolerende neutrofiler fra rotteknoglemarv og sammenligner NET-sekretionsfunktionerne hos rotteperifere og knoglemarvsneutrofiler. De to skitserede metoder imødekommer forskellige eksperimentelle mål, hvilket begge resulterer i tilstrækkelige mængder rotteknoglemarvsneutrofiler, samtidig med at antallet af nødvendige rotter reduceres. To-trins isolationsmetoden viste overlegen neutrofilrensning, mens et-trinsmetoden viste sig tidseffektiv med acceptable rensningsniveauer. Desuden sammenlignede forskerne NETosis og NET-dannelse mellem rotteknoglemarvsneutrofiler og deres perifere modstykker og fandt samme styrke som PMN. Disse resultater bidrager væsentligt til neutrofilrelaterede undersøgelser af atrieflimren og understreger vigtigheden af fleksibelt at vælge forskellige kilder til neutrofilisolering hos forskellige forsøgsdyr med forskellige neutrofilfordelinger.
Isolering af neutrofiler udgør et afgørende trin i studiet af NETosis, hvor valget af en passende isolationsmetode er afgørende for at opnå pålidelige resultater. En vigtig faktor at veje er forekomsten af lymfocytforurening under isolering. Håndtering af denne udfordring er særlig vigtig, når man isolerer rotteneutrofiler fra knoglemarv. På trods af det særskilte tæthedsområde for neutrofiler (1,0814-1,0919, med en top ved 1,0919) sammenlignet med lymfocytter (1,0337-1,0765, med en top ved 1,0526), forbliver…
The authors have nothing to disclose.
Finansiering: Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr. 82004154, 81900311, 82100336 og 81970345).
A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |