Unik tilnærming for isolering av rottebenmarg nøytrofiler med sammenlignbar kapasitet

Summary

Denne undersøkelsen skisserer to teknikker for å isolere rikelig nøytrofile ekstracellulære feller (NET) fra rottebenmarg. Den ene metoden kombinerer et kommersielt nøytrofilt isolasjonssett med sentrifugering av tetthetsgradient, mens den andre bare benytter sentrifugering av tetthetsgradient. Begge tilnærmingene gir funksjonelle NET som overgår de fra nøytrofiler i perifert blod.

Abstract

Hovedmålet med denne forskningen var å utvikle en pålitelig og effektiv tilnærming for å isolere nøytrofile ekstracellulære feller (NET) fra rottebenmarg. Denne innsatsen oppsto på grunn av begrensninger knyttet til den tradisjonelle metoden for å ekstrahere NET fra perifert blod, hovedsakelig på grunn av mangel på tilgjengelige nøytrofiler for isolasjon. Studien avslørte to forskjellige metoder for å skaffe rotte nøytrofiler fra benmarg: en strømlinjeformet ett-trinns prosedyre som ga tilfredsstillende rensingsnivåer, og en mer tidkrevende to-trinns prosess som viste forbedret rensingseffektivitet. Det er viktig at begge teknikkene ga en betydelig mengde levedyktige nøytrofiler, som varierte mellom 50 og 100 millioner per rotte. Denne effektiviteten gjenspeilet resultatene oppnådd ved å isolere nøytrofiler fra både humane og murine kilder. Det er signifikant at nøytrofiler avledet fra rottebenmarg viste sammenlignbare evner til å utskille NET sammenlignet med nøytrofiler oppnådd fra perifert blod. Imidlertid produserte den benmargsbaserte metoden konsekvent betydelig større mengder av både nøytrofiler og NET. Denne tilnærmingen demonstrerte potensialet til å skaffe betydelig større mengder av disse cellulære komponentene for videre nedstrøms applikasjoner. Spesielt holder disse isolerte NET og nøytrofiler løfte om en rekke applikasjoner, som spenner over rikene av betennelse, infeksjon og autoimmune sykdommer.

Introduction

Neutrofiler utgjør en kritisk delmengde av leukocytter som spiller en sentral rolle i den medfødte immunresponsen. De er preget av multilobed kjerner og granulater som inneholder forskjellige proteaser og antimikrobielle peptider¹. Neutrofiler fungerer primært gjennom degranulering, fagocytose og dannelse av NET. Observasjonen av NET ble først gjort av Takei et al. i 1996 under et eksperiment hvor nøytrofiler ble stimulert med phorbol myristate acetate (PMA) ². Deretter ble prosessen med NET-dannelse laget “NETosis” av Brinkmann et ^al.3 i 2004. Deres forskning belyste videre den avgjørende rollen som NET i nøytrofilmedierte antimikrobielle responser. NET er nettlignende strukturer sammensatt av kromatin, histoner og antimikrobielle proteiner som frigjøres fra aktiverte nøytrofiler som respons på smittsomme og inflammatoriske stimuli. NET kan immobilisere og drepe invaderende patogener ved å fange dem og utsette dem for en høy konsentrasjon av antimikrobielle peptider og proteaser ^1,3. I tillegg bidrar NET til clearance av apoptotiske celler og deltar i betennelsesoppløsning. Nylige studier indikerer også at overdreven dannelse av NET eller nedsatt NET-nedbrytning kan føre til vevskader, autoimmune sykdommer, trombogenese og nedsatt revaskularisering 4,5,6,7,8,9,10.

Den patogene rollen til NET i ukontrollert fibrose etter hjerteinfarkt og dannelsen av ventrikulære aneurismer har blitt demonstrert gjennom utvidelse av perivaskulær fibrose ^4,11. Myokardinfarktmodellen og isoleringen av nøytrofiler fra benmarg hos mus er begge veletablerte. Polymorfonukleære (PMN) leukocytter, en type hvite blodlegemer rikelig i humant blod, tjener som en utmerket kilde for å isolere humane nøytrofiler. Denne metoden eliminerer behovet for å høste benmarg, og dermed øke sikkerheten og effektiviteten.

NET spiller også en rolle i atrieflimmer forbundet med hjerteremodellering. Imidlertid ble store dyr som hunder og griser brukt til å modellere atrieflimmer, da mus mangler et atrium som er stort nok til å etablere en re-entrant syklus eller AF-modellen, med mindre spesifikke ionekanaler eller signalveier blir slått ned eller slått ut¹². Mens det er mulig å indusere atrieflimmer hos rotter og isolere nøytrofiler fra rotte perifert blod som tidligere beskrevet, oppdaget forskerne en begrensning der bare 2 x 10^5-5 x 10^{5 nøytrofiler} kunne isoleres fra perifert blod (10 ml per rotte). Ekstrahering av tilstrekkelige NET på hvert tidspunkt krevde ca. 10-25 rotter (5 x 10⁶ nøytrofiler totalt), noe som resulterte i en tidkrevende, kostbar og ofte lav avkastningsprosess¹³. I denne forbindelse presenterer Li He og kolleger en beinmargsorientert strategi for å oppnå tilstrekkelige NET fra rotter¹⁴. I sin artikkel gir de en omfattende beskrivelse av isolering av nøytrofiler fra rotte benmarg og sammenligner NET-sekresjonsegenskapene til rotte perifere og benmarg nøytrofiler. De to metodene skissert imøtekomme til forskjellige eksperimentelle mål, begge resulterer i tilstrekkelige mengder rotte benmarg nøytrofiler samtidig redusere antall nødvendige rotter. To-trinns isolasjonsmetoden viste overlegen nøytrofil rensing, mens ett-trinns metoden viste seg tidseffektiv med akseptable rensenivåer. Videre sammenlignet forskerne NETosis og NET-dannelse mellom rottebenmarg nøytrofiler og deres perifere kolleger, og fant lik styrke med PMN. Disse funnene bidrar betydelig til nøytrofilrelaterte studier av atrieflimmer og understreker viktigheten av fleksibelt å velge forskjellige kilder for nøytrofil isolasjon i forskjellige forsøksdyr med forskjellig nøytrofilfordeling.

Protocol

Studien ble utført under en prosjektlisens (nr. 20211404A) gitt av Animal Ethics Committee of West China Hospital, Sichuan University, i samsvar med retningslinjene fra Animal Ethics Committee of West China Hospital, Sichuan University for omsorg og bruk av dyr. I samsvar med etiske retningslinjer ble rottene som ble brukt i denne studien holdt i et kontrollert miljø med en 12 timers lys / mørk syklus, temperatur ved 22-24 ° C og fuktighet på 50% -60%. Rottene fikk tilgang til mat og vann ad libitum. Dyrene som ble …

Representative Results

Protokollen som er skissert her, avgrenser to forskjellige metoder, hver preget av forbedret rensing eller strømlinjeformede trinn. Begge metodene ga ca. 0,5 x 108-1 x 108 nøytrofile per rotte. Flowcytometrianalyse, ved bruk av vedlegget V-FITC / PI apoptosedeteksjonssett, viste celle levedyktighet over 90%, sammenlignbar med mus og menneskelige kolleger (figur 1). Mens lymfocyttforurensning syntes uunngåelig under nøytrofil isolasjon fra benmarg, viste totrinnsmeto…

Discussion

Isoleringen av nøytrofiler utgjør et sentralt trinn i å studere NETosis, hvor valg av en passende isolasjonsmetode er avgjørende for å oppnå pålitelige resultater. En viktig faktor å veie er forekomsten av lymfocyttforurensning under isolasjon. Å adressere denne utfordringen er spesielt viktig når man isolerer rotte nøytrofiler fra benmarg. Til tross for det distinkte tetthetsområdet for nøytrofiler (1,0814-1,0919, med en topp på 1,0919) sammenlignet med lymfocytter (1,0337-1,0765, med en topp på 1,0526), …

Materials

A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32790
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32744
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1	Invitrogen, USA	A21125
Anti-rat myeloperoxidase	Abcam, England	ab134132
Anti-rat neutrophil elastase	Abcam, England	ab21595
Celigo Image Cytometer	Nexelom, USA	200-BFFL-5C
DNase I	Sigma, USA	10104159001
fetal bovine serum (FBS)	Gibco, USA	10099141C
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, USA	C14175500BT
Hoechst	Thermofisher, USA	33342
Isoflurane	RWD, China	R510-22-10
Mowiol	Sigma, USA	81381
Normal Donkey Serum	Solarbio, China	SL050
Paraformaldehyde	biosharp, China	BL539A
Penicillin-streptomycin	Hyclone, USA	SV30010
Percoll	GE, USA	P8370-1L
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, USA	P1585
Picogreen dsDNA Assay Kit	Invitrogen, USA	P11496
Rat neutrophil isolation kit	Solarbio, China	P9200
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, China	R1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media	Hyclone, USA	SH30809.01B
RWD Universal Animal Anesthesia Machine	RWD, China	R500
Sprague Dawley (SD) rats	Dashuo, China
SytoxGreen	Thermofisher, USA	S7020
Tris-EDTA (TE) buffer	Solarbio, China	T1120
Triton-X-100	Biofroxx, German	1139ML100